生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达_高嫱.pdf

黑龙江农业科学 ２０１８（３）１９－２５Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｈａａｓｅｐ．ｃｎＤＯＩ１０．１１９４２／ｊ．ｉｓｓｎ１００２－２７６７．２０１８．０３．００１９生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过 程 中的表达高嫱１，田守 蔚２，张洁２，王艳 萍２，孙宏 贺２，张海 英２，许勇２（１．北京 农学院 植物科学技术学院 ，北京１０２２０６；２．北京 市农林科学院 蔬菜研究中心 ／农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 ／蔬菜种质改良北京重点实验室 ，北京１０００９７）摘 要 生长素在植物果实发育与成熟过程中发挥重要作用 ，但生长素调控西瓜果实发育与成熟的分子机制尚不 十分清楚 。以含糖量低的野生西瓜 ＰＩ２９６３４１－ＦＲ与含糖量高的栽培西瓜 ９７１０３为试 验材料 ，测定并比较了栽培与野生西瓜果实发育不同时期果实整组织游离态 ＩＡＡ的含 量 。结果表明 果实游离态 ＩＡＡ的含 量随西瓜果实发育而上升 ，在授粉后 １８ｄ达到 峰值 ，后期逐步下降 。含糖量高的栽培西瓜果实游离态 ＩＡＡ的含 量在果实发育的各个阶段 ，均显著高于含糖量低的野生西瓜 ，说明果实游离态 ＩＡＡ的积 累可能与果实成熟及含糖量积累相关 。已有研究表明生长素酰胺水解酶 （ＩＡＡ－Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ１－ｌｉｋｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＩＬＲ１－ｌｉｋｅ ｈｙｄｒｏ－ｌａｓｅ，ＩＬＬ）通过催化结合态生长素释放游离态 生长素 ，是游离态生长素积累的限速酶 。在西瓜全基因组上对ＩＬＬ基 因家族进行了系统进化树分析，通 过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测了西瓜各个组织的表达情况 ，发现西瓜果肉中只有 ４个 ＩＬＬ基因 表达 ，并且栽培西瓜果肉中这 ４个基因的表达量均显著高于野生西瓜 ，其中 ，Ｃｌａ０１７６６１在栽培西瓜果肉中的表达量最高 ，且 与果实游离态 ＩＡＡ的含 量变化趋势正相关 ，推测该基因对栽培西瓜游离态ＩＡＡ的积累起关键作用，进而调控了西瓜果实的发育与成熟的进化 。关 键 词 生长素 ；西瓜 ；游离 ；ＩＡＡ；生长素酰胺水解酶收 稿 日期 ２０１８－０１－１０基金 项目 北京学者资助项目 （ＢＳＰ０２６）；国家 西甜瓜产业技术体系资助项目 （ＣＡＲＳ－２５）；北京西甜瓜创新团 队资助项目 （ＢＡＩＣ１０－２０１７）。第一 作者简介 高嫱 （１９９０－），女 ，在读 硕士 ，从事蔬菜育种与生物技术研究 。Ｅ－ｍａｉｌ１１９２０３９７５７＠ｑｑ．ｃｏｍ。通讯 作者 许勇 （１９６５－），男 ，博士 ，研 究员 ，从事蔬菜育种研究 。Ｅ－ｍａｉｌｘｕｙｏｎｇ＠ｎｅｒｃｖ．ｏｒｇ。肉质果实的 发育与成熟是复杂而高度协调的过程 ，依赖于多个植物生长激素的协调作用［１］，其中生长素在果 实发育的过程中起到了不可替代的作用 。生长素不仅对果实坐果起重要作用［２］，还能通 过调控细胞分裂和细胞扩增 ，决定果实最终大小［３］。在一 些水果作物中 ，生长素含量的下降被认为是果实启动成熟的先决条件［４］。外施 生长素可以干扰许多作物的果实成熟过程［５］。植物 生长素的主要天然活性形式是吲哚乙酸 （ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＩＡＡ），通过植物自身的色氨酸 依赖途径及色氨酸非依赖途径合成［６］。合成有 活性的游离态ＩＡＡ可以 通过酯键与糖结合 ，或通过酰胺键与氨基酸或肽结合 ，成为非活性的结合态ＩＡＡ，植物 体９５％的生 长素以结合态形式存在［７－８］。ＩＡＡ以结 合态形式存储 、运输 ，其后在生长素 酰 胺 水 解 酶 （ＩＡＡ－Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ１－ｌｉｋｅＨｙｄｒｏｌａｓｅ，ＩＬＲ１－ｌｉｋｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＩＬＬ）作 用 下 水解产生游离态ＩＡＡ，在不 同发育过程中提供具有生物活性的生长素［９］。拟南 芥的ＩＬＬ蛋白 家族有７个成员 ，其中ＡｔＩＡＲ３的主 要底物是ＩＡＡ－Ａｌａ，参与 调控了拟南芥对干旱胁迫的响应［１０－１１］。ＡｔＩＬＲ１、ＡｔＩＡＲ３及ＡｔＩＬＬ２基因 ，通 过调控游离态ＩＡＡ的含 量进而参与调节了光照条件下下胚轴的延伸及侧根的发生 、根毛的延伸［１２－１３］。芜菁受到根肿菌侵 染 ，肉质 根 中 的ＩＡＡ含 量 增 加 可 能 与ＢｒＩＡＲ３和ＢｒＩＬＬ６的 表 达 量 变 化 相 关［１４］；ＭｔＩＡＲ３３和ＭｔＩＡＲ３４调控 了 蒺 藜 苜 蓿 根 部 受 真 菌 侵 染 时ＩＡＡ含量 的增加［１５］。桃ＩＬＬ家族 的ＰｐＩＬＲ１基因在 桃果实成熟过程表达量上调了９倍 ，可能通过催化生长素氨基酸结合态水解的形式参与了溶质型桃果实成熟阶段的生长素的跃变过程 ，进而调控桃果实发育过程［１６］。因此 ，ＩＬＬ蛋白 通过调控游离态ＩＡＡ的释放调控了植 物的众多发育过程 。果实发育与成熟过程与游离态ＩＡＡ的含 量息息相关 。西瓜作为非呼吸跃变型果实发育研究的理想模式作物 ，生长素对其果实发育与成熟过９１黑龙江农业科学 ３期程的 研究尚在起步阶段 ，生长素在西瓜果实发育过程的含量变化尚未有研究报道 ，关于生长素酰胺水解酶对此过程的调控作用尚不清楚 。本研究首次报道了含糖量低的野生型西瓜与含糖量高的栽培型西瓜果实发育过程中的生长素含量变化差异 ；利用生物信息学分析方法 ，鉴定并分析西瓜全基因 组ＩＬＬ家 族 成 员 的 基 本 特 征 通 过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测 了西瓜ＩＬＬ基因 在野生型及栽培型西瓜果实发育过程的表达差异 ，为ＩＬＬ基因 家族成员的功能解析奠定了基础 。１ 材 料 与方法１．１ 材料以 野 生 型 种 质 “ＰＩ２９６３４１－ＦＲ”（Ｃ．ｌａｎａｔｕｓｖａｒ．ｃｉｔｒｏｉｄｅｓ）与早熟栽培西瓜 自交系９７１０３（Ｃ．ｌａｎａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）为供 试材料 。野生材料由课题组从美国引进并保存 ，授粉后约５０ｄ种子成 熟 ，但果实可溶性糖含量极低 ，无甜味 ，瓤色白且硬 ；早熟栽培种西瓜由本课题组选育并保存 ，授粉后约３０ｄ成熟 ，成熟果实含糖量 高 ，中心瓤甜 ，可溶性固形物１１％左右 ，瓤 色红 ，肉质脆酥 。早熟栽培西瓜果实发育过程有４个关键期 １．未成熟 白 瓤 期 （授 粉 后１０ｄ，ＤＡＰ）；２．白 粉 瓤期 （１８ＤＡＰ）；３．红 瓤 期 （２６ ＤＡＰ）；４．过 熟期 （３４ＤＡＰ）［１６］。以此 作为取样时间点 。１．２ 方法１．２．１ 果实整组织游离态ＩＡＡ含量 的测定游离态ＩＡＡ的含 量测定在中国农业大学生物科学院质谱 （ＭＳ）实验室进行 。分别采集 “ＰＩ２９６３４１－ＦＲ”、９７１０３授粉 后１０、１８、２６、３４、４２及５０ｄ的西瓜 果实各部位样品 。采集的样品在液氮中冷冻后 ，储存在－８０℃冰箱 。测 定时将样品粉碎成细粉 ，取０．１ｇ样 品 置 于１．５ｍＬ离 心 管 ，加 入５００μＬ提取 液 （异丙醇∶水∶盐酸＝２∶１∶０．００２，ｖ／ｖ／ｖ）和５０μＬ内标 （１００μｇ·Ｌ－１）溶液 ，涡 旋振荡１０ｓ，在４℃、３００ｒ·ｍｉｎ－１条件 下振荡３０ｍｉｎ，加入１ｍＬ萃取 液 （氯仿溶液 ），涡旋振荡１０ｓ，在４℃、３００ｒ·ｍｉｎ－１条件 下振荡３０ｍｉｎ，相同 温度下１４ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，两相 形成 ，转移下层液体１．２ｍＬ，室温下氮气吹干 ，用０．１ｍＬ甲醇 溶液复溶 ，１４ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ后 ，取上 清液装入进样小瓶 ，上机待测 。所用液相色谱仪为Ｗａ－ｔｅｒｓ ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａ－ｔｉｏｎ，３４ Ｍａｐｌｅ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，０１７５７ＵＳＡ），使用 色谱柱Ｐｏｒｅｓｈｅｌ ＥＣ－１２０（３．０ｍｍ１００ｍｍ，３ｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）进行 色谱分离 ，采用以下溶剂梯度分离ＩＡＡ（Ａ相 水含０．０５％乙酸 ；Ｂ相 乙 腈含０．０５％乙酸 ）０ｍｉｎ，１０％Ｂ；６．２５ ｍｉｎ，４０％Ｂ；７．５ ｍｉｎ，９０％Ｂ；１０．５ｍｉｎ，９０％Ｂ；１０．６ｍｉｎ，１０％Ｂ；１３．５ｍｉｎ，１０％Ｂ；流速 为０．３ｍＬ·ｍｉｎ－１，上样 量为５μＬ。使用高分辨质谱仪Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏ－ｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）进行 质谱分析 ，参数设置如下 Ｉｏｎ ＳｏｕｒｃｅＨＥＳＩ，ＳｐｒａｙＶｏｌｔａｇｅ（－）３０００，ＣａｐｉｌａｒｙＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ３２０，Ｓｈｅａｔｈ Ｇａｓ３０，ＡｕｘＧａｓ１０，Ｓｐａｒｅ Ｇａｓ５，Ｐｒｏｂｅ Ｈｅａｔｅｒ Ｔｅｍｐ．３５０，Ｓ－Ｌｅｎｓ ＲＦ Ｌｅｖｅｌ５５，保留 时间和ＩＡＡ的质 谱信息取决于标准品 。每个样本重复３次 。１．２．２ 可溶 性固形物含量的测定用手持式ＡＴＣ－１Ｅ糖度 计 （ＡＴＡＧＯ，Ｔｏｋｙｏ）测定 西瓜果实中心果肉组织的可溶性固形物含量 。１．２．３ 西瓜ＩＬＬ家族 基因序列检索利用拟南芥基因组数据库获得ＩＬＬ基因 的编码序列 ，通过检索 葫 芦 科 基 因 组 数 据 库 （ｈｔｔｐ／／ｃｕｃｕｒｂｉｔ－ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／）对西 瓜蛋白组序列进行比对 ，选取阈值小于ｅ－５序列 ，根 据基因注释去除非ＩＬＬ基因后 ，以 此序列集合在西瓜蛋白组序列内再次做ＢＬＡＳＴＰ比对 检索 （ｅ－ｖａｌｕｅ＝１ｅ－５），在匹 配序列中筛除非ＩＬＬ序列 后列为西 瓜ＩＬＬ候 选 基 因序列 。１．２．４ 西瓜ＩＬＬ蛋白 家族进化与结构分析从拟南芥基因组数据库中获得拟南芥ＩＬＬ蛋白 家族 序 列 （ＡｔＩＬＲ１，ＡＴ３Ｇ０２８７５；ＡｔＩＡＲ３，ＡＴ１Ｇ５１７６０；ＡｔＩＬＬ１，ＡＴ５Ｇ５６６５０；ＡｔＩＬＬ２，ＡＴ５Ｇ５６６６０；ＡｔＩＬＬ３，ＡＴ５Ｇ５４１４０；ＡｔＩＬＬ５，ＡＴ１Ｇ５１７８０；ＡｔＩＬＬ６，ＡＴ１Ｇ４４３５０），并从 检索获得的转录本序列翻译出西瓜ＩＬＬ蛋白 家族序列 ，用ＣｌｕｓｔａｌＸ １．８３进行 序列比对 （ａｌｉｇｎｍｅｎｔ），使用ＭＥＧＡ ７．０［１７］软件 构建ＭＬ系统发育树 ，做５００次ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，其它 参数为系统默认值 。１．２．５ 西瓜ＩＬＬ基因在 不同组织部位的表达分析ＲＮＡ提取 试剂盒购自华越洋生物公司 ；反转录试剂盒为ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅＴＭ Ｋｉｔ，由Ｉｎｖｉｔｒｏ－ｇｅｎ提供 ；荧 光定量ＰＣＲ试剂 盒购自ＴａＫａＲａ公司 ；引物由北京天一辉远 生物科技有限公司合成 。用ＲＮＡ提取 试剂盒分别提取 ，分别取９７１０３根 、顶端 生长点 、叶片组织 ，９７１０３和ＰＩ２９６３４１－ＦＲ授粉后１０、１８、２６、３４、４２、５０ｄ的果 肉组织总ＲＮＡ。使用ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅＴＭ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）对各０２３期 高 嫱等生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达样品ＲＮＡ进行 纯化 。以纯化后的ＲＮＡ样品 为模板 ，利用试剂盒ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）进行 反转录 ，获得ｃＤＮＡ。反转 录得到的ｃＤＮＡ稀释１０倍 ，用作 反应模板 。以西瓜Ａｃｔｉｎ基因 作为内参 ，利用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０型荧 光定量ＰＣＲ仪 （Ｒｏｃｈｅ）对基 因 （引物见表１）进行定量ＰＣＲ分析 。采 用比较Ｃ－Ｔ法计 算各基因的相对表达量 。表１ 荧光定量ＰＣＲ扩增的引物序列Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ基 因 登录号Ｇｅｎｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．上 游 引物Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ下 游 引物Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒＣｌａ０１１２４２ ＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴ ＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＧＣｌａ０１７６６１ ＧＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡ ＡＣＣＣＴＴＴＡＣＧＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＴＧＡＣｌａ０１８４２２ ＣＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧ ＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣｌａ０１０１１８ ＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴ ＧＣＴＣＣＣＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣｌａ０１２６３０ ＧＣＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴ ＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣｌａ０１３９３０ ＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣ ＴＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＣｌａ００７７９２（Ａｃｔｉｎ）ＣＣＴＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＧＴＧ ＧＡＡＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧ１．２．６ 数据 分析采用Ｅｘｃｅｌ ２０１０软件 进行数据分析 。２ 结 果 与分析２．１ 野生西瓜与栽培 西瓜果实整组织游离态ＩＡＡ的含 量变化检测 “ＰＩ２９６３４１－ＦＲ”、９７１０３两个品种西瓜果实不 同发育时期整组织游离态ＩＡＡ的含 量变化 ，结果显示 ，二者游离态ＩＡＡ的含 量均呈现先升后降趋势 ，１８ｄ达到 最高值 ，而后下降 。在果实发育后期 ，野生西瓜游离态ＩＡＡ的含量几乎降为零 ，而栽 培品种仍维持较高含量的游离态ＩＡＡ。栽培 西瓜在授粉１０ｄ后的果实发育的各个阶段游离态ＩＡＡ的含量显著高于野生西瓜 （图１）。栽培 品种９７１０３可溶 性固形物含量在白粉瓤期（１８ｄ）以后 迅速积累 ，一直增加 ，只在过熟期略有降低 ，而野生品种ＰＩ２９６３４１－ＦＲ可溶性固形物含量一 直很低 （图２），不难推测出 ，栽培西瓜后期较高含量的游离态ＩＡＡ可能 对其可溶性固形物的积累起重要的作用 。潘磊等［１７］在桃果实发育中也发 现同样现象 。２．２ 西瓜 生长素酰胺水解酶基因家族的全基因组鉴定与进化树分析前人的研究结果表明 ，ＩＡＡ以结 合态形式存储 、运输 ，生长素酰胺水解酶 （ＩＡＡ－Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｅ－ｓｉｓｔａｎｔ１－ｌｉｋｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＩＬＲ１－ｌｉｋｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＩＬＬ）可以 将其水解产生游离态ＩＡＡ，是游 离态ＩＡＡ积累 的限速酶 ，因此西瓜果实游离态ＩＡＡ积累可 能与ＩＬＬ基因 有关 ，有必要进一步在西瓜全基因组上鉴定分析ＩＬＬ基因 家族成员 。目前在以拟南芥上已鉴定出７个ＩＬＬ基因 （ＡｔＩＬＲ１，ＡＴ３Ｇ０２８７５；ＡｔＩＡＲ３，ＡＴ１Ｇ５１７６０；ＡｔＩＬＬ１，ＡＴ５Ｇ５６６５０；ＡｔＩＬＬ２，ＡＴ５Ｇ５６６６０；ＡｔＩＬＬ３，ＡＴ５Ｇ５４１４０；ＡｔＩＬＬ５，ＡＴ１Ｇ５１７８０；ＡｔＩＬＬ６，ＡＴ１Ｇ４４３５０），通过 其编码区在西瓜基因组数据库中进 行 比 对 ，在西瓜中共得到６个ＩＬＬ基因 （表２）。不 同 小写 字 母 表 示 在 ０．０５水 平 差 异 显 著 性 （Ｐ＜０．０５）。下同 。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．图 １不同类型西瓜果实中游离态 ＩＡＡ含量 的变化Ｆｉｇ．１ Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｆｒｅｅ ＩＡＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｆｒｕｉｔｓ图 ２不同类型西瓜果实中可溶性固形物含量的变化Ｆｉｇ．２ Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｏｌｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｆｒｕｉｔｓ１２黑龙江农业科学 ３期表２ 西瓜 基因组中ＩＬＬ基因 家族的特征Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬＬ ｇｅｎｅｓ ｆａｍｉｌｙｉｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ基 因 登录号Ｇｅｎｅａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．染色 体定位ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＮｏ．预测 的蛋白 Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ氨 基 酸长度 ／ａａＬｅｎｇｔｈ分子 量 ／ｋＤＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ结构 域Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ二聚 化结构域Ｍ２０ｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎＣｌａ０１１２４２ ３ ４４３ ４８．４６ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ２０ ＋Ｃｌａ０１７６６１ １０ ７６２ ８４．１５ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ２０ －Ｃｌａ０１８４２２ ４ ４８４ ５２．６９ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ２０ －Ｃｌａ０１０１１８ ５ ３８９ ４２．４２ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ２０ ＋Ｃｌａ０１２６３０ ７ ４４５ ４９．０３ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ２０ ＋Ｃｌａ０１３９３０ ８ ５０２ ５５．３５ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｍ２０ ＋＋表示存在此结构域 。＋ｍｅａｎｓ ｄｏｍａｉｎ ｅｘｉｓｔ．利用 进化树分析软件ＭＥＧＡ７．０对西 瓜的６个和 拟 南 芥 的７个ＩＬＬ蛋 白 序 列 （ＡｔＩＬＲ１，ＡＴ３Ｇ０２８７５；ＡｔＩＡＲ３，ＡＴ１Ｇ５１７６０；ＡｔＩＬＬ１，ＡＴ５Ｇ５６６５０；ＡｔＩＬＬ２，ＡＴ５Ｇ５６６６０；ＡｔＩＬＬ３，ＡＴ５Ｇ５４１４０；ＡｔＩＬＬ５，ＡＴ１Ｇ５１７８０；ＡｔＩＬＬ６，ＡＴ１Ｇ４４３５０）进行 进化分析 。由图３可以看出 ，西瓜和拟南芥的ＩＬＬ蛋白 主要分为３大类 ，西瓜中 的Ｃｌａ０１２６３０、Ｃｌａ０１１２４２、Ｃｌａ０１０１１８、Ｃｌａ０１３９３０基 因 编 码 的 蛋 白 和 拟 南 芥ＡＴ１Ｇ５１７６０（ＡｔＩＡＲ３）、ＡＴ１Ｇ５１７８０（ＡｔＩＬＬ５）、ＡＴ５Ｇ５６６５０（ＡｔＩＬＬ１）、ＡＴ５Ｇ５６６６０（ＡｔＩＬＬ２）和ＡＴ１Ｇ４４３５０（ＡｔＩＬＬ６）蛋白 聚为一类 ，Ｃｌａ０１７６６１、Ｃｌａ０１８４２２编码 的蛋白与ＡＴ３Ｇ０２８７５（ＡｔＩＬＲ１）和ＡＴ５Ｇ５４１４０（ＡｔＩＬＬ３）聚 为 一 类 。其 中 ，Ｃｌａ０１７６６１与ＡＴ３Ｇ０２８７５（ＡｔＩＬＲ１）亲缘 关系较近 ，可能具有相似功能 。图 ３西 瓜 和拟南芥 ＩＬＬ蛋白家族的系统进化树分析Ｆｉｇ．３ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＬＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍＣｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙＭａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｍｅｔｈｏｄ２．３ 西瓜ＩＬＬ基因 在不同组织部位的表达分析分别提取９７１０３授粉 后１８ｄ的根 、叶 、顶 端生长点 、果柄及果肉组织 ，利用荧光定量ＰＣＲ对候选６个ＩＬＬ基因 的表达情况进行分析 。以１８ｄ时Ｃｌａ０１２６３０在果柄组织的表达 量作为１，从图４中可以看出 ，Ｃｌａ０１２６３０和Ｃｌａ１３９３０在根 部的表达量最高 ，排在第３位的是Ｃｌａ０１８４２２它的 表达 量 约 为Ｃｌａ０１２６３０的５０％，Ｃｌａ０１１２４２、Ｃｌａ０１７６６１和Ｃｌａ０１０１１８表达 量较低 。与其它器官相比 ，西瓜ＩＬＬ基因 家族在叶片中的表达量均相 对 较 低 。在 顶 端 生 长 点 中 ，主 要 表 达Ｃｌａ０１７６６１、Ｃｌａ０１１２４２基因 ，其 它ＩＬＬ基因 表达量 较 低 。果柄组织中主要表达Ｃｌａ０１１２４２、Ｃｌａ０１３９３０基 因 ，其 次 为Ｃｌａ０１７６６１、Ｃｌａ０１２６３０基因 ，Ｃｌａ０１８４２２与Ｃｌａ０１０１１８表达 量极低 。在果肉组织中 ，Ｃｌａ０１８４２２和Ｃｌａ０１０１１８表达 量极低 ，几乎为０。Ｃｌａ０１７６６１表达 量最高 ，高出排在第二 位 的Ｃｌａ０１１２４２将 近 一 倍 ，Ｃｌａ０１２６３０和Ｃｌａ０１３９３０表达 量约为Ｃｌａ０１７６６１的３０％。图 ４９７１０３中 ＩＬＬ基因在西瓜不同组织的表达情况Ｆｉｇ．４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＩＬＬｓ ｇｅｎｅ ｏｆ ９７１０３ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ２２３期 高 嫱等生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达２．４ ＩＬＬ基因 在野生及栽培西瓜果实发育过程中的表达差异分析分别提取ＰＩ２９６３４１－ＦＲ授粉 后１０、１８、２６、３４、４２、５０ｄ和９７１０３授粉 后１０、１８、２６、３４ｄ的果肉 组织总ＲＮＡ，对比 检测４个ＩＬＬ基因 在野生与栽培西瓜品种果肉中表达差异情况 ，取相同时期９７１０３果 皮 作 对 照 。以 授 粉 后１０ｄ时Ｃｌａ０１２６３０在果 皮组织的表达量作为１。从图５中可以看出 ，除Ｃｌａ０１３９３０基因 以外 ，其余３个基因 在９７１０３果肉中的表达均显著高于在ＰＩ２９６３４１－ＦＲ果肉 及９７１０３果皮 的表达 ，并且在野生果肉与９７１０３果皮 的表达情况基本相同 。其中 ，Ｃｌａ０１７６６１、Ｃｌａ０１１２４２在９７１０３果肉 表达量变化趋势与果实整组织游离态ＩＡＡ的浓 度变化趋势类似 ，都在授粉后１８ｄ达到最高 ，在授粉后２６ｄ降低 ，又 在３４ｄ有所 上调 。这３个基因均表现出在含糖量高的组织表达量高 ，栽培西瓜的果瓤高于野生西瓜的果瓤 ，栽培西瓜的果皮 （含糖量也低 ）与野生西瓜的果瓤同样表现出较低的表达量 。其中Ｃｌａ０１７６６１表达 量最大 ，推测其在水解结合态生长素中发挥更大的作用 。图 ５ＩＬＬ基因在不同类型西瓜果实中的表达情况Ｆｉｇ．５ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＩＬＬｓ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｆｒｕｉｔｓ３ 结 论 与讨论生长 素很早就被报道参与果实发育过程 ，外施生长素会扰乱正常的果实成熟过程［５］，此外 生长素对果实坐果及果实大小的调控也起到关键作用［１］。除此 以外 ，在一些报道中 ，提出了果实组织中生长素合成或信号传导与糖积累之间的联系［１８－１９］，但生 长素如何影响糖代谢进而影响果实品质的机理还不清楚 。在烟草细胞中 ，生长素抑制了淀粉粒的发育 ，淀粉生物合成主要酶的积累受生 长 素 的 影 响［２０］。下调生长素响应因子ＳｌＡＲＦ４的表 达的转基因番茄 ，在果实发育早期积累更多的淀粉 ，后期积累更多的糖［２１］。西瓜 起 源 于 非 洲 ，西 瓜 祖 先 品 种 （Ｃ．ｃｏｌｏ－ｃｙｎｔｈｉｓ或Ｃ．ｌａｎａｔｕｓ ｖａｒ．ｃｉｔｒｏｉｄｅｓ，或其 它 ）有着白而坚硬的果肉 、厚厚的果皮 、极低的含糖量 ，味苦 ，以上性状均有利于在雨季到来之前保护种子 ，防止种子过早被传播［２２］。经过 人为驯化过程 ，现代栽培西瓜和野生西瓜祖先品种在外观和成分上有着明显的不同 ，这些变化的结果就是由不成熟并苦涩的野生西瓜变成了完全成熟并甜的栽培西瓜 。目前西瓜驯化过程的关键影响因素的研究还很少 ，西瓜由不甜的野生品种驯化为可以积累糖分的栽培品种 ，涉及的关键因子有待于进一步研究 。本研究测量了野生品种 “ＰＩ２９６３４１－ＦＲ”、早熟栽 培西瓜品种９７１０３果实 不同发育时期整组织的游离态ＩＡＡ浓度 的变化情况 ，发现不同类型西瓜果实游离态ＩＡＡ的浓 度变化有差异 。二者游离态ＩＡＡ的含 量均呈现先升后降趋势 ，１８ｄ达到３２黑龙江农业科学 ３期最高 值 ，而后下降 。这可能与种子发育有关 ，种子早期形成与发育会合成大量游离态ＩＡＡ，成熟后 ，游 离态ＩＡＡ的含 量迅速降低［２３］，导致 果实整组织游离态ＩＡＡ的降 低 。在果实发育中后期 ，果实整组织的游离态ＩＡＡ主要 来源于果肉 ，野生西瓜游离态ＩＡＡ的含 量几乎降为零 ，而栽培品种仍维持较高含量的游离态ＩＡＡ。此时是栽培西瓜果肉 中可溶性固形物迅速积累期 （决定西瓜含糖量 ），游离态ＩＡＡ可能 是栽培西瓜果肉糖分积累的关键因素 。总体上看 ，栽培西瓜在果实发育的各个阶段游离态ＩＡＡ的含 量显著高于野生西瓜 ，这与栽培西瓜同化物积累的能力显著高于野生型相吻合 。ＩＡＡ作为 重要的植物激素 ，其含量的变化对植物生长发育有重要的影响 。除了从头合成途径 ，从结合态ＩＡＡ水解 释放出有活性的ＩＡＡ也是其 重要来源 ，生长素酰胺水解酶ＩＬＬ基因 在此过程发挥了重要的作用［２４－２５］。最早在拟南芥发现并 鉴定了生长素酰胺水解酶ＩＬＬ基因［２６］，后在许 多植物中陆续发现ＩＬＬ蛋白 通过调控游离态ＩＡＡ的释 放调控了植物的众多发育过程 。其中 ，桃ＩＬＬ家族 的ＰｐＩＬＲ１基因在 桃果实成熟过程表达量上调了９倍 ，可能通过催化生长素氨基酸结合态水解的形式参与了溶质型桃果实成熟阶段生长素 的 跃 变 过 程 ，进而调控桃果实发育过程［１６］。目前ＩＬＬ基因 家族的 功 能 研 究 还 十 分有限 。本研究从西瓜基因组数据库中鉴定出６个ＩＬＬ家 族 成 员 ，编 码 的 氨 基 酸 长 度 在３８９～７６２ａａ。ｑＲＴ－ＰＣＲ结果 显示 ，西瓜ＩＬＬ家族 基因中Ｃｌａ０１７６６１、Ｃｌａ０１１２４２及Ｃｌａ０１２６３０在栽 培西瓜果肉中的表达量 ，明显高于野生西瓜果肉 ，且在整个果实发育时期保持相对较高水平 ，这与栽培西瓜果实整组织游离态ＩＡＡ的含量较高相一致 。其 中 ，分析发现Ｃｌａ０１７６６１基因 的表达量变化趋势与果实整组织游离态ＩＡＡ的浓 度变化趋势一致 ，推测该基因是调控西瓜果实生长素含量的关键基因 。进化树结果显示 ，Ｃｌａ０１７６６１编码 的蛋白与拟南芥ＩＬＲ１亲缘 关系较近 。ＩＬＲ１主要 水解ＩＡＡ－Ｌｅｕ和ＩＡＡ－Ｐｈｅ［１１］，推测Ｃｌａ０１７６６１主要以ＩＡＡ－Ｌｅｕ和ＩＡＡ－Ｐｈｅ为底 物 ，调节西瓜果实游离态ＩＡＡ的含 量 ，进而参与栽培西瓜可溶性固形物的积累 。进一步对果实差异表达的ＩＬＬ家族 基因的功能开展解析 ，将会探明生长素调控西瓜果实成熟及糖分积累的分子机制 ，本项研究为此奠定了良好工作基础 。参考文献 ［１］Ｋｕｍａｒ Ｒ，Ｋｈｕｒａｎａ Ａ，Ｓｈａｒｍａ Ａ Ｋ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｆｌｅｓｈｙｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，２０１４，６５（１６）４５６１－４５７５．［２］Ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｍ，Ｍａｒｉａｎｉ Ｃ，Ｖｒｉｅｚｅｎ Ｗ Ｈ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｘｉｎ ａｎｄｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｓｅｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，２００９，６０（５）１５２３－１５３２．［３］Ｄｅｖｏｇｈａｌａｅｒｅ Ｆ，Ｄｏｕｃｅｎ Ｔ，Ｇｕｉｔｔｏｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｐ－ｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｘｉｎ ｉｎ ａｐｐｌｅ（Ｍａｌｕｓ ｘｄｏｍｅｓｔｉｃａ）ｆｒｕｉｔ ｓｉｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１２（１）７．［４］Ｇｉｖｅｎ Ｎ Ｋ，Ｖｅｎｉｓ Ｍ Ａ，Ｇｉｅｒｓｏｎ Ｄ．Ｈｏｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆｒｉｐｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ，ａ ｎｏｎ－ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ ｆｒｕｉｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎ－ｔａ，１９８８，１７４（３）４０２－４０６．［５］Ｃｏｈｅｎ Ｊ Ｄ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ａ ｒｏｌｅｆｏｒ ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ－ｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，１２１（３）５２０－５２４．［６］Ｎｏｒｍａｎｌｙ Ｊ，Ｃｏｈｅｎ Ｊ Ｄ，Ｆｉｎｋ Ｇ Ｒ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ ｒｅｖｅａｌ ａ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ－ｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９３，９０（２１）１０３５５－１０３５９．［７］Ｃａｍｐａｎｅｌａ ＪＪ，Ｌｕｄｗｉｇ－Ｍｕｅｌｅｒ Ｊ，Ｔｏｗｎ Ｃ Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９６，１１２（２）７３５－７４５．［８］Ｎｏｒｍａｎｌｙ Ｊ．Ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ ｃｅｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ ａｕｘｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ－ｂｏｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，２（１）ａ００１５９４．［９］Ｗｏｏｄｗａｒｄ Ａ Ｗ，Ｂａｒｔｅｌ Ｂ．Ａｕｘｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎ－ｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，２００５，９５（５）７０７－７３５．［１０］Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｎ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｋａｓａｈａｒａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＩＡＡ－Ａｌａ Ｒｅｓｉｓｔ－ａｎｔ３，ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｍｉＲ１６７，ｍｅｄｉ－ａｔｅｓ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｏｓ－ｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ，２０１２，２４（９）３５９０－３６０２．［１１］ＬｅＣｌｅｒｅ Ｓ，Ｔｅｌｅｚ Ｒ，Ｒａｍｐｅｙ Ｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＩＡＡ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｆｒｏｍＡｒ－ａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２７７（２３）２０４４６－２０４５２．［１２］Ｒａｍｐｅｙ Ｒ Ａ，ＬｅＣｌｅｒｅ Ｓ，Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆａｕｘｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｆｒｅｅ ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，１３５（２）９７８－９８８．［１３］Ｓｔｒａｄｅｒ Ｌ Ｃ，Ｃｕｌｅｒ Ａ Ｈ，Ｃｏｈｅｎ Ｊ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｄｏｌｅ－３－ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｏ ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄｄｒｉｖｅｓ ｃｅｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５３（４）１５７７－１５８６．［１４］Ｓｃｈｕｌｅｒ Ａ，Ｌｕｄｗｉｇ‐ Ｍüｌｅｒ Ｊ．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｕｘｉｎ ｃｏｎｊｕ－ｇａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｌｕｂｒｏｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２００６，１７１（１）１４５－１５８．［１５］Ｃａｍｐａｎｅｌａ ＪＪ，Ｓｍｉｔｈ Ｓ Ｍ，Ｌｅｉｂｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｕｘｉｎ ｃｏｎｊｕ－ｇａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘ－４２３期 高 嫱等生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２００８，２７（１）２６－３８．［１６］Ｇｕｏ Ｓ，Ｓｕｎ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｄｅ－ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１５，１０（６）ｅ０１３０２６７．［１７］潘磊 ，曾 文芳 ，牛良 ，等 ．桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析 ［Ｊ］．园 艺 学 报 ，２０１５，４２（２）２４３－２５１．［１８］Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉ Ｔ，Ｒｏｔｉｎｏ Ｇ Ｌ，Ｃａｍｅｒｉｎｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅ ａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙ ｐａｒｔｈｅｎｏｃａｒｐｉｃ ｆｒｕｉｔｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｔｏｍａｔｏｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，２（１）１－１１．［１９］Ｗａｎｇ Ｈ，Ｓｃｈａｕｅｒ Ｎ，Ｕｓａｄｅｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｅａｔｕｒｅｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｐｏｌｉｎａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｏｍａｔｏｆｒｕｉｔ ｓｅｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏ－ｆｉｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ，２００９，２１（５）１４２８－１４５２．［２０］Ｍｉｙａｚａｗａ Ｙ，Ｓａｋａｉ Ａ，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉｍａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｘｉｎ ａｎｄ ｃｙ－ｔｏｋｉｎｉｎ ｈａｖｅ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ａｍｙｌｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄｂｒｉｇｈｔ ｙｅｌｏｗ－２ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１２１（２）４６１－４７０．［２１］Ｓａｇａｒ Ｍ，Ｃｈｅｒｖｉｎ Ｃ，Ｍｉｌａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｌ－ＡＲＦ４，ａｎ ａｕｘｉｎ ｒｅ－ｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１６１１３６２－１３７４．［２２］Ｃｈｏｍｉｃｋｉ Ｇ，Ｒｅｎｎｅｒ Ｓ Ｓ．Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｏｒｉｇｉｎ ｓｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｌｉｎｎａｅａｎ ｍａｔｅｒｉａｌａｎ－ｏｔｈｅｒ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ｍｕｓｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２０１５，２０５（２）５２６－５３２．［２３］Ｔｉｗａｒｉ Ａ，Ｖｉｖｉａｎ－Ｓｍｉｔｈ Ａ，Ｌｊｕｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅｓ ｏｆｆｒｕｉｔ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａ－ｒｕｍ，２０１３，１