黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病分布及病菌生物学特性.pdf

北 方 园 艺 研究论文 第一作者简介 张笛 女 硕士研究生 研究方向为 植物病原生物学 责任作者 张艳菊 女 博士 教授 现主要从事植 物病原生物学及有害生物综合治理等研究工作 基金项目 国家自然科学基金资助项目 黑龙 江省自然科学基金重点资助项目 收稿日期 黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病分布及 病菌生物学特性 张 笛 刘 齐 月 刘 东 陶 磊 王 春 龙 张 艳 菊 东北农业大学 农学院 黑龙江 哈尔滨 摘 要 对黑龙江省保护地发生的黄瓜棒孢叶斑病的发生情况进行调查 对疑似该病的 致病菌进行形态学及分子生物学鉴定 同时以鉴定出的黄瓜棒孢叶斑病菌菌株 为 试验材料 采用菌落生长法和玻片法对病原菌的生物学特性进行测定 结果表明 黄瓜棒孢 叶斑病菌的病原菌为多主棒孢霉 该病在黑龙 江省哈尔滨 齐齐哈尔 牡丹江等多地均有发生 病原菌菌丝生长的最适温度为 最 适碳源为甘露醇 最适氮源为甘氨酸 最适 为 光照条件有利于菌丝的生长 菌丝致死 温度为 分生孢子致死温度为 分生孢子在 时萌发率最高 关键词 黄瓜 棒孢叶斑病 多主棒孢霉 分布 生物学特性 中图分类号 文献标识码 文章编号 由 半 知 菌 丝 孢 目 棒 孢 属 多 主 棒 孢 霉 侵 染引起的棒孢叶斑病是近年流行的一种新病害 对黄瓜生产造成的损失日益严重 多主棒孢霉于 年在欧洲首次报道 年在中国报道该 病菌可 侵 染 黄 瓜 但 因 侵 染 数 量 少 未 引 起 重 视 年黄瓜棒孢叶斑病在辽宁省瓦房店 市大面积发生 成为当地保护地黄瓜的主要病 害 近 年 来 该 病 在 我 国 山 东 河 南 河 北 上海 甘肃 广东 宁夏 等地均有 发生 给黄瓜生产造成严重损失 严重时甚至高达 该病菌寄主广泛 不仅可以侵染 黄瓜 还能够侵染甜瓜 木瓜 橡胶 番茄 大豆等 余种植物 该病菌主要以菌丝体或分生 孢子随种子 病残体在土壤中或其它寄主植物上 越冬 田间分生孢子通过气流和雨水传播 进行多 次重复侵染 发病严重时可造成叶片干枯 提早 拉秧 年张艳菊等 在黑龙江省哈尔滨市发 现棒孢叶斑病疑似病株 并对黑龙江省哈尔滨 齐 齐哈尔 牡丹江和佳木斯等地黄瓜棒孢叶斑病发 生情况进行调查 结果只在哈尔滨发现有棒孢叶 斑病危害 而在齐齐哈尔 牡丹江和佳木斯均未发 现棒孢叶斑病 由于病菌可随种子及气流进行传 播 经过几年时间 该病是否已经传播到了黑龙江 省其他地区以及危害情况如何不得而知 因此课 题组于 年对黑龙江省黄瓜保护地棒孢叶斑 病发生 分布及危害情况进行调查 并对黄瓜多主 棒孢霉生物学特性进行了研究 以期为科学指导 黄瓜棒孢叶斑病的防治提供参考依据 材料与方法 试验材料 供试菌株为 年采自黑龙江省黄瓜种植 区分离得到的致病性最强的黄瓜棒孢叶斑病菌 株 命名为 试验方法 黄瓜棒孢叶斑病发生情况调查 于 年 月 对黑龙江省哈尔滨 齐齐哈 尔 牡丹江 佳木斯和绥化 个黄瓜主栽区 个 村的 个黄瓜种植大棚黄瓜棒孢叶斑病的发生 情况进行调查 每个大棚调查 株 统计该病 在这些地区的发病率及病情指数 对于疑似病株 带回实验室进行病菌分离 鉴定及致病性测定 发病率 该地区发病大棚数 该地区调 查大棚数 病情指数 各级病株数 各级值 调查总 株数 最高级值 病原菌的分离与纯化 疑似病叶用常规组织分离法进行病原菌的分 离 取病健交界处大小为 的叶片 组织 依次经 酒精浸泡 升汞消毒 无菌水冲洗 次后用无菌滤纸吸干 置于 培养基平板上 恒温培养 致病性测定 将纯化后的菌种转移到 培养基上扩繁 培养 用无菌的涂棒将菌丝刮下并加入无菌水 配制成浓度为 个 的孢子悬液 选 用感病黄瓜品种 由东北农业大学黄瓜育 种研究室提供 用喷雾法 对其叶片进行接种 接种后套袋保湿 后观察发病情况 根 据柯赫氏法则测定其致病性 病原菌形态鉴定 将病原菌在 平板上培养 观察其形 态 用灭菌钩挑取少许霉层 于 显微镜下观察并拍照 并测量分生孢子的大小 病原菌的分子鉴定 菌块在 上培养一周 刮下菌丝 采用改 良的 法 提取各菌株的 用真菌通 用引物 和特异性引物 进行 扩增 将扩增产物送往上 海生工公司进行测序 测序结果进行同源性比较 生物学特性测定 温度对菌丝生长的影响 取 培 养 的 菌落 用灭 菌 的 打 孔 器 取 直 径 的菌块移 至 平板上 然后分别置于 和 恒温培养 十字交叉法测量培 养 的菌落直径 每个处理重复 次 碳源对菌丝生长的影响 以 培养 基为基础 将其中的蔗糖分别按比例替换成葡萄 糖 果糖 淀粉 乳糖 甘露醇 共 种不同碳源的 培养基 每个处理 次重复 取培养 的菌落 用灭菌的打孔器取直径 的菌块移至培养基 平板上 恒温无光照培养 测量方法同上 氮源对菌丝生长的影响 以 培养 基为基础 将其中的硝酸钠分别按比例替换成蛋 白胨 酵母浸粉 磷酸氢二铵 甘氨酸 种不同氮 源的培养基 每个处理 次重复 取培养 的 菌落 用灭菌的打孔器取直径 的菌块移至 培养基平板上 恒温无光照培养 测量方法 同上 对菌丝生长的影响 用 的 和 的 将 培养基分 别调成 为 共 个处理 取培养 的菌落 用灭 菌的打孔器取直径 的菌块移至不同 的 培养基平板上 恒温无光照培养 测量方法 同上 光照对菌丝生长的影响 取直径 的 菌块放入 培养基 分别置于 连续光照 培养 完全黑暗培养 明暗交替 种光 照 条件培养下 测量方法同上 菌丝致死温度和时间测定 取直径 菌块装入无菌 管中 放入恒温水浴锅中分别 在 处理 后迅速 冷却 将菌丝挑取出并置于 培养基上 后观察菌丝生长情况 每个处理重复 次 温度对分生孢子萌发的影响 将病原菌在 平板上培养 后 用无菌水将培养基表面 的菌丝刮下 于 倍显微镜下配制成浓度为 每个视野 个孢子的悬浮液 用移液枪取 滴入凹玻片中 放置于垫有湿滤纸的培养皿 内 分别于 恒温培 养 后镜检孢子萌发情况 每处理重复 次 北 方 园 艺 月 上 分生孢子致死温度和时间测定 将病原菌 在 平板上培养 后 用无菌水将培养基表 面的菌丝刮下 于 倍显微镜下配制成浓度 为每个视野 个孢子的悬浮液 取 菌悬液装入无菌 管中 在 的恒温水浴锅中分别处理 后迅速冷 却 用移液枪取 不同处理的菌悬液布于 平板上 于 培养箱中恒温培养 后 观察培养基上是否生成菌落 每处理重复 次 数据分析 采用 软件对试验数据进行处理及 分析 结果与分析 黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病发生情况 由表 可知 在调查的 个村中 只有齐齐 哈尔的大民村 小花力村和大花力村没有发现黄 瓜棒孢叶斑病 其他村均发生黄瓜棒孢叶斑病危 害 牡丹江和佳木斯地区发病率较高 而齐齐哈尔 和哈尔滨地区发病率较低 发病较为严重的地区 为齐齐哈尔市的小五福马村 佳木斯的临江村和 亨利村 病情指数分别为 和 表 黑龙江省各地区黄瓜棒孢叶斑病发病率及病情指数 地区 大棚数 栋 发病棚数 栋 每棚调查植株数 株 病棚病情指数 哈尔滨市 光明村 大民村 齐齐哈尔市 小花力村 大花力村 小五福马村 新胜村 铁岭河 牡丹江市 夹信子屯 新兴村 大莫村 富华村 佳木斯市 临江村 亨利村 范家村 小康村 绥化市 厢红五村 展望村 病原菌分离及形态鉴定 对采集的疑似病斑分离 获得棒孢叶斑病菌 菌株 株 菌落在 培养基上形态基本一致 为近圆 形 气 生 菌 丝 呈 灰 白 色 绒 毛 状 且 茂 密 图 培养基内菌丝呈黑褐色 边缘颜色较浅 图 分生孢子梗细长 直立或弯曲 有 个层出梗 分生孢子多隔膜 大小范围在 呈圆柱状 直立或弯曲的 倒棍棒状 分生孢子单生或串生 颜色呈褐色 具 有 个隔膜 多集中在 个 图 将制备好的孢子悬浮液接种在黄瓜感病品种 第一片真叶上 后产生直径约为 的病斑 图 与田间症状相似 将病斑进行组 织分离培养后 获得多主棒孢病菌 故确定该菌为 致病菌 分子鉴定 使用真菌 通用引物和黄瓜多主 棒孢霉特异性引物 以 个菌株的基 因组 为模板进行 扩增 均获得长度约 为 图 和 图 的特异性片 段 选择致病性最强的菌株 对其扩增 产物进行回收 测序 得到的 片段大小分别 为 和 图 将序列放在 上 进行 分析 与多主棒孢病菌相似性达到 第 期 北 方 园 艺 该 菌 株 登 录 号 分 别 为 和 进而在分子水平上确定该病菌为 多 主 棒 孢 霉 注 气生菌丝 基内菌丝 图 菌株在 上的菌落形态 注 分生孢子单生倒棍棒状 分生孢子圆柱状 分生孢子串生倒棍棒状 分生孢子梗 图 菌株的分生孢子及分生孢子梗 注 对照组 处理组 图 病原菌致病性测定 北 方 园 艺 月 上 注 通用引物 特异性引物 图 菌株 扩增结果 图 序列比对结果 病原菌的生物学特性 温度对菌丝生长的影响 不同温度下在 培养基上菌落生长的平 均直径大小见图 在 下培养菌丝生 长较快 其中 最为突出 但 个温度下差异 不显著 在 时生长速度相对缓慢 时菌丝生长速度最慢 表明温度过高或过低 均不利于菌丝生长 碳源对菌丝生长的影响 菌丝在供试 种碳源培养基上均能生长 由 图 可知 其中在以甘露醇为碳源的培养基生长 速度最快 其次为蔗糖和乳糖 但与甘露醇的差异 不显著 以淀粉为碳源的培养基上菌丝生长速度 最慢 与其余 种培养基上菌丝生长表现为显著 性差异 氮源对菌丝生长的影响 菌丝在供试 种氮源培养基上均能生长 由 图 可知 其中在以甘氨酸为氮源的培养基上生长 注 字母代表 水平下组间显著异性 下同 图 不同温度对菌丝生长的影响 速度最快 与其余 种培养基上菌丝生长相比表现 为显著性差异 在以磷酸氢二铵为氮源 的培养基上生长速度最慢 但在以酵母浸粉为氮 源的培养基上形成的菌落较厚 其余均较薄 第 期 北 方 园 艺 图 不同碳源对菌丝生长的影响 图 不同氮源对菌丝生长的影响 对菌丝生长的影响 菌丝在 均可生长 由图 可知 时菌丝的生长速率差异性不显著 但在 为 的时候菌丝生长速率最快 说明 在接 近中性的时候最利于菌丝的生长 图 不同 对菌丝生长的影响 光照对菌丝生长的影响 由图 可知 菌丝在全光照条件下生长速度 最快 且与全黑暗条件下菌丝的生长速度差异显 著 说明光照有利于菌丝的生长 图 不同光照对菌丝生长的影响 温度对分生孢子萌发的影响 由图 可知 分子孢子 均能萌发 和 孢子萌发率相对较高 其中 时 孢子萌发率最高 近 由此可见温度过高过 低都不利于孢子的萌发 图 不同温度对分生孢子萌发的影响 菌丝及分生孢子致死温度的测定 菌丝在 处理 后 有 个重复无菌 落生成 在 处理 后 个重复均未有 菌落产生 分生孢子在 处理 后未有孢 子萌发 表明菌丝的致死温度为 分生孢子的致死温度为 表 北 方 园 艺 月 上 表 菌丝致死温度及时间 处理温度 菌丝生长情况 注 表示生长 表示不生长 个 或 表示 次重复 下同 表 分生孢子致死温度及时间 处理温度 菌丝生长情况 讨论与结论 试验研究结果表明 黄瓜棒孢叶斑病在黑龙 江省多个黄瓜保护地区均有发病 牡丹江和佳木 斯地区发病率较高 齐齐哈尔市的小五福马村 佳 木斯的临江和享利村发病较为严重 年黄 瓜棒孢叶斑病仅在黑龙江省哈尔滨市发生 而 到 年在齐齐哈尔市 牡丹江市 佳木斯市和 绥化市均有发生 该病菌可通过种表附着或种内 潜伏休眠菌丝在黄瓜上进行种子传播 在种表 附着状态下可存活 个月以上 翌年产生分生孢 子成为田间初侵染菌源 初侵染后的病斑产 生的分生孢子可继续凭借气流向其它黄瓜植株传 播 从而完成再侵染 这也是造成黄瓜棒孢叶斑病 在黑龙江普遍发生的主要原因 病原菌菌丝生长的最适温度为 与 木薯 豇豆 甜瓜 广藿香 和香蕉 的 多主棒孢霉的最适温度基本一致 但茄子和香蕉 的多主棒孢霉最适生长温度的范围更大 菌丝及 分生孢子的致 死 温 度 分 别 为 和 与木薯 和茄子 多主棒孢霉的 结论一致 分生孢子在 时孢子萌发率最高 较甜瓜 和节瓜 上的相关研究相差不多 但 与二者不同温度的产孢率存在差异 该病原菌菌 丝对酸碱度不敏感 在 时均可生长 最 适 为 但香蕉 上的多主棒孢霉对酸碱 度敏感 仅在 接近中性时可生长 最适碳源 为甘露醇 最适氮源为甘氨酸 光照条件有利于 菌丝的生长 但影响不显著 但光照对甜瓜 上 的多主棒孢霉的生长影响显著 不同作物上多主 棒孢霉生物学特性研究的差异 可能因寄主与地 理来源不同而产生 菌丝及分生孢子的致死温度分别为 和 因此可在播种前对种子进 行热处理来减少病害的初侵染源 此外 在 月 黄瓜拉秧后 及时进行病残体的清理 并用塑料薄 膜覆盖 使温度超过 通过高温杀死病菌 防 止菌丝及分生孢子越夏 减少下一茬种植的初侵 染源 黑龙江省黄瓜种植面积大 黄瓜棒孢叶斑 病是近年来黄瓜种植区的主要病害之一 未发生 该病害的地区更应加强防范 拉秧后彻底及时清 除病残体 目前在黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病已由 次要病害变为主要病害 危害日益严重 由于多主 棒孢霉的寄主范围广 而且主要通过气流传播 因 此今后应在加强黄瓜棒孢叶斑病的防治的基础 上 密切注意在其它寄主上的发生及危害 参考文献 戚佩坤 白金恺 朱桂香 吉林省栽培植物真菌病害志 北京 科学出版社 李龙生 李宝聚 刘永春 等 黄瓜褐斑病的诊断与防治 中国蔬菜 许远 张子君 邹庆道 等 黄瓜褐斑病的药剂防治研究 辽宁农业科学 李长松 张眉 李林 等 山东省黄瓜棒孢叶斑病 褐斑病 病原菌鉴定和防治 中国蔬菜 王润初 河南省温棚蔬菜病害发生动态与综合防治 植 物医生 刘智慧 倪守煜 刘会清 张家口市保护地黄瓜靶斑病的发 生与防治 植物保护 曾蓉 陆金萍 戴富明 上海地区黄瓜靶斑病病原鉴定及 的分析 上海交通大学学报 农业科学版 柳晓玲 魏周玉 王安士 等 几种药剂防治日光温室黄瓜靶 第 期 北 方 园 艺 斑病田间效果 甘肃农林科技 蓝国兵 谭耀华 何自福 等 黄瓜褐斑病 在广东首次报道 植物保护 查仙芳 朱猛蒙 王国珍 等 宁夏首次发现黄瓜靶斑病 宁夏农林科技 杨双娟 顾兴芳 张圣平 等 黄瓜棒孢叶斑病 的研究概况 中国蔬菜 张艳菊 刘东 马柏壮 等 黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病发生情 况调查及 病 原 鉴 定 东北农业大学学报 潘羡心 彭建华 刘先宝 等 不同来源橡胶树多主棒孢病菌 致病性及基础生物学特性的比较 热带作物学报 王爽 黄贵修 李博勋 等 甜瓜棒孢叶斑病病原菌鉴定及其 生物学特性研究 热带作物学报 番华彩 郭志祥 白亭亭 等 香蕉棒孢霉叶斑病病原菌生物 学特性测定 南方农业学报 陈旭玉 甘炳春 隋春 等 广藿香棒孢霉叶斑病病原菌生物 学特性及药剂筛选 农药 王爽 黄贵修 李博勋 等 海南茄子棒孢霉叶斑病病原菌鉴 定及生物学特性研究 现代农业科技 陆宁海 吴利民 田雪亮 等 黄瓜褐斑病菌侵染条件及致病 性研究 安徽农业科学 刘丽 黄瓜霜霉菌致病型 交配型的测定及 遗传多样 性分析 哈尔滨 东北农业大学 裴月令 时涛 蔡吉苗 等 木薯棒孢霉叶斑病病原鉴定及其 生物学特性测定 热带作物学报 刘志恒 李健冰 安心 等 辽宁省豇豆轮纹病病原菌鉴定及 其生物学特性 中国蔬菜 韩小爽 高苇 傅俊范 等 李宝聚博士诊病手记 三十五 黄瓜棒孢叶斑病的诊断与防治 中国蔬菜 曾永三 孙伟 梁关生 等 节瓜枯萎病病原鉴定及生物学特 性研究 仲恺农业技术学院学报 北 方 园 艺 月 上