基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定.pdf

p园艺学报， 2018， 45 6 1136– 1146. Acta Horticulturae Sinica nbsp; 1136 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0879； http //www. ahs. ac. cn 收稿日期 2018– 02– 01； 修回日期 2018– 06– 04 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31471897） ；辽宁省高等学校优秀人才支持计划 A 类项目（ LR2013029） nbsp;* E-mail ； Tel 024-88487143 基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定 nbsp;孙红梅1,2,*，付麟岚1，王志平1，盖美竹1，王春夏1,2（1沈阳农业大学园艺学院，沈阳 nbsp;110866；2设施园艺省部共建教育部重点实验室，沈阳 nbsp;110866） nbsp;摘 nbsp;要 以细叶百合（ Lilium pumilum DC. Fisch.）和兰州百合（ Lilium davidii var. unicolor）的鳞片和胚性愈伤组织作为诱导材料，用不同浓度秋水仙素以浸泡和混培两种处理方式进行多倍体诱导。以形态学观测、根尖染色体计数、气孔观测对多倍体植株进行倍性鉴定，分别获得了 19 株细叶百合四倍体植株和 6 株兰州百合四倍体植株，最佳处理方式为 0.1秋水仙素浸泡胚性愈伤组织 24 h。使 用 ISSR 对经体细胞胚发生的二倍体和多倍体再生植株进行遗传分析，发现两种百合二倍体植株遗传较稳定，而多倍体植株均发生遗传变异，其中细叶百合和兰州百合遗传变异率分别为 15.48和 9.75。 nbsp;关键词 细叶百合；兰州百合；体细胞胚发生；多倍体； ISSR 中图分类号 S 682.2 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 文章编号 0513-353X（ 2018） 06-1136-11 Polyploidy Induction and Identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor Based on Somatic Embryogenesis SUN Hongmei1,2,*， FU Linlan1， WANG Zhiping1， GAI Meizhu1， and WANG Chunxia1,2（1College of Horticulture， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；2Key Laboratory of Protected Horticulture of Education Ministry and Liaoning Province， Shenyang 110866， China） nbsp;Abstract Using scales and embryogenic callus as the target tissues， Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor were accomplished the ployploid inducement by soaking and mixed culture with different concentrations of colchicine. Nineteen tetraploids of Lilium pumilum DC. Fisch. and 6 tetraploids of Lilium davidii var. unicolor have been identified， through morphological observation， root tip chromosome count and stomatal observation. The optimum condition is immersing embryogenic callus with 0.1 colchicine for 24 hours to achieve the highest efficiency of chromosome doubling. Dipold plants of both lilies are genetically stable while polyploid plants experience the genetic variation by using ISSR to conduct the genetic analysis of plants via somatic embryogenesis. The variation rates of polyploid in Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor are 15.48 and 9.75， respectively. Keywords Lilium pumilum； Lilium davidii var. unicolor； somatic embryogenesis； polyploid； ISSR 原产于中国的细叶百合（ Lilium pumilum DC. Fisch.）和兰州百合（ Lilium davidii var. unicolor） ， nbsp;孙红梅，付麟岚，王志平，盖美竹，王春夏 . 基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 6 1136– 1146. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1137 具有较高的观赏价值和较强的抗逆性，但二者茎秆纤弱、叶片细狭、花朵娇小、结实率低等（ Pitschmann et al.， 2013） 。在植物进化史中，多倍体化扮演着重要的角色（ Sattler et al.， 2016） ，是遗传、生化以及进化之源（ Soltis amp; Soltis， 2016） 。植物多倍体化后除了基因组加倍导致新的表型外，也因组织结构和生理上的变化导致了器官“巨大”化及开花时间提前等（ Levin， 1983； Guo et al.， 2017） 。在百合中，育种学家对亚洲百合（ Zhou et al.， 2008） 、紫斑百合（李旦 nbsp;等， 2017）、淡黄花百合（钟程 nbsp;等， 2015）、有斑百合（张锡庆 nbsp;等， 2017）等展开了多倍体化研究，发现与二倍体植株相比，多倍体植株鳞茎更大，鳞片更加厚实，花朵更显硕大艳丽，叶片着色更深，株形更紧凑和营养生长时间更为短暂。 nbsp;目前，多倍体诱导多使用传统的杂交育种（ Nakel et al.， 2017； Zhang et al.， 2017） 、种子诱导（ Noori et al.， 2017） 、不定芽诱导（李晓双 nbsp;等 ， 2017）等方法，但变异情况较为复杂，常伴有大量嵌合体（ Cabral et al.， 2016； He et al.， 2016b），并且需要不断鉴定、选择才能保证变异株的倍性稳定。体细胞胚发生是体细胞获得胚性能力、形成完整植株的离体再生方式（ Zimmerman， 1993），在很大程度上体现了细胞的全能性（吴泽 nbsp;等， 2014），短时期内可获得大量再生植株（ Jin et al.，2012； Zhang et al.， 2016），且倍性稳定（ Pitschmann et al.， 2013）。依托体细胞胚发生体系进行多倍体植株诱导，遗传稳定性好，繁殖效率高，可有效避免嵌合体形成。目前已有包括欧洲栎（ Endemann et al.， 2001）、栓皮槠（ Loureiro et al.， 2005）、白鹤芋（ Eeckhaut et al.， 2004）在内的一些植物成功实现了以体细胞胚为受体的多倍体创制，这些多倍体植株均具有更为优良的农艺性状。然而，由于植物体细胞胚的诱导具有基因型依赖性强、畸形胚比例较高且难以同步化的特点，目前尚未有以体细胞胚为受体材料诱导百合多倍体的报道。 nbsp;本试验在前期建立细叶百合和兰州百合体细胞胚发生体系的基础上（ Zhang et al.， 2016），用秋水仙素进行多倍体诱导，比较不同诱导时间和处理方式对多倍体诱变率的影响，并综合使用形态学观测、根尖染色体计数、气孔观测等进行加倍植株的倍性鉴定；使用 ISSR 分子标记技术进行多倍体植株遗传分析，以期为提升其观赏价值并创制新种质奠定基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;试验材料及培养条件 nbsp;本试验于 2016 年 1 月至 2017 年 6 月在沈阳农业大学园艺学院观赏植物栽培生理实验室进行，所用试管苗来自本实验室保存的兰州百合和细叶百合离体材料。 nbsp;采用 MS 固体培养基（添加 30 g L-1蔗糖 nbsp; 7 g L-1琼脂） ，胚性愈伤组织诱导培养基（ M1）为MS 1.0 mg L-1毒莠定（ PIC） 0.2 mg L-1萘乙酸（ NAA） ，体细胞胚萌发培养基（ M2）为 MS 0.5 mg L-16–苄氨基腺嘌呤（ 6-BA） 。所有培养基 pH 调至 5.8 并在 121 ℃、 120 kPa 条件下灭菌20 min。 nbsp;1.2 nbsp;体细胞胚发生 nbsp;取鳞茎直径为 1 2 cm 的细叶百合和兰州百合试管苗的鳞片用于体细胞胚诱导。将鳞片切割为0.5 cm2，凹面朝上平铺接种于 M1培养基中黑暗培养，诱导 45 d 后将胚性愈伤组织转移至 M2培养基中光培养（光照 16 h d-1，黑暗 8 h d-1，光照强度 36 μmol m-2 s-1），以获得再生植株。 nbsp;Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1138 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1136– 1146. 1.3 nbsp;多倍体诱导 nbsp;以细叶百合试管苗鳞片和胚性愈伤组织为受体，分别采用浸泡法和混培法进行多倍体诱导。浸泡法指将鳞片和胚性愈伤组织分别于 0.01、 0.05和 0.1秋水仙素水溶液（体积比）中浸泡 24、48 和 72 h 后，鳞片转入 M1培养基中以诱导产生胚性愈伤组织；胚性愈伤组织转入 M2培养基中以获得体细胞胚再生植株，蒸馏水处理作对照。混培法是将两种百合试管苗鳞片和胚性愈伤分别接种于添加 0.05、 0.1和 0.5秋水仙素的 M1和 M2培养基中，培养 10、 20 和 30 d 后再分别接种于不添加秋水仙素的 M1培养基和 M2培养基中， 以常规培养基作对照， 筛选出细叶百合的最佳诱导处理，并用该处理诱导兰州百合多倍体。每个处理 20 个外植体， 3 次重复，变异率（ ） 变异植株 /再生植株总数 nbsp; 100。 nbsp;1.4 nbsp;再生植株根尖染色体鉴定 nbsp;取 1.3 获得的再生植株幼嫩根尖置于 0.1的秋水仙素溶液中 4 ℃预处理 24 h； 转移至卡诺氏固定液（乙醇 ︰ 冰醋酸 nbsp; 3︰ 1）中固定 12 h；于 5 mol L-1HCl 中室温下解离 4 min；最后置于卡宝品红染液中染色 20 min。每个植株至少观察 10 个清晰的分裂相，统计染色体数。 nbsp;1.5 nbsp;再生植株与多倍体植株的 ISSR 检测 nbsp;在未经加倍处理的细叶百合和兰州百合二倍体植株中分别选取 20 个 ISSR 引物对（ A30、 A26、A37、 A59、 A50、 UBC811、 UBC814、 UBC815、 UBC820、 UBC825、 UBC835、 UBC842、 UBC843、UBC844、 UBC845、 UBC857、 UBC873、 UBC880、 UBC895） 进行引物筛选 （ UBC 和 3A 系列， TaKaRa，Japan） 。母株和体细胞胚再生植株之间的遗传稳定性通过基于 PCR 的 ISSR 技术进行检测。每个引物对随机选取 10 株体细胞胚再生植株检测。使用 Nuclean PlantGen DNA Kit（ Cwbiotech， Beijing，China）提取植株新鲜叶片组织 DNA，使用 Infinite 1200 PRO（ Tecan， Mnnedorf， Switzerland）检测 DNA 质量。 nbsp;使用 DNA Veriti Thermal Cycler（ Applied Biosystems， California， USA）进行 DNA 扩增。 ISSR反应体系为 40 ng 模板 DNA、 12.5 μL TaqMix DNA 聚合酶、 1 μL 引物、 10.5 μL RNA Free Water，总体积为 25 μL；扩增程序为 94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 40 s， 52.8 ℃退火 45 s， 72 ℃延伸 1 min，共 40 个循环；最后 72 ℃延伸 7 min 30 s。 ISSR-PCR 扩增产物在 1.5琼脂糖凝胶上，于 3 5 V cm-1的电场中电泳 30 min，在凝胶成像系统中观察、照相并记录。每次 ISSR 检测进行 3 次重复。 nbsp;经多倍体倍性鉴定后，将正常二倍体植株与加倍植株转移到鳞茎膨大培养基中（添加 60 g L-1蔗糖的 MS 培养基） ，继代两次（ 60 d） ，观察小鳞茎和叶片情况。每种百合不同倍性植株各取 3 株，以叶片为材料再次进行 ISSR 检测，将二倍体植株作为对照，选取筛选出的条带清晰可分的 ISSR 引物进行 ISSR 检测， 试验具体步骤同上。 多态性条带变异率 （ ） 多态性条带数 /总检测条带数 nbsp; 100。 nbsp;1.6 nbsp;四倍体植株的形态学和细胞学观察 nbsp;在相同生长条件下，观察并利用游标卡尺测量二倍体与四倍体植株鳞茎直径、鳞片厚度、叶片宽度和叶柄直径，观察两种百合试管苗移栽后的表型变化。气孔观察和叶绿素含量测定参照Widoretno（ 2016）和 Alsiņa 等（ 2016）的方法。 nbsp;孙红梅，付麟岚，王志平，盖美竹，王春夏 . 基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 6 1136– 1146. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1139 2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;细叶百合和兰州百合多倍体诱导及倍性鉴定 nbsp;细叶百合鳞片和胚性愈伤组织经秋水仙素浸泡和混培处理，与正常培养基上生长的相比，体胚萌发推迟了 20 d。在诱导过程中，无论是以鳞片还是胚性愈伤组织为受体，都伴随有褐化或致死的现象，所有受体在处理 30 d 后全部死亡。综合比较，以胚性愈伤组织为受体诱导更快，并且多倍体诱变率更高，最终确定细叶百合多倍体诱导的最佳处理方式为以胚性愈伤组织为受体， 0.1秋水仙素浸泡处理 24 h，多倍体诱变率为 48（表 1） 。利用这一诱导条件，也成功诱导培育了兰州百合的多倍体植株。 nbsp;表 1 nbsp;细叶百合多倍体诱导结果 nbsp;Table 1 nbsp;Induction effects of colchicine concentration and treatment time on Lilium pumilum DC. Fisch. 处理 nbsp;Treatment 秋水仙素 / Colchicine 时间 nbsp;Time nbsp;再生植株 nbsp;Regeneration plant 变异株 nbsp;Mutant 诱变率 / Mutation rate 非整倍体 nbsp;Aneuploid 四倍体 nbsp;Tetraploid 鳞片 nbsp;Scale 胚性愈伤 nbsp;Embryo- genic callus鳞片Scale胚性愈伤 nbsp;Embryo- genic callus鳞片 nbsp;Scale 胚性愈伤 nbsp;Embryo- genic callus鳞片Scale胚性愈伤 nbsp;Embryo- genic callus 鳞片 nbsp;Scale 胚性愈伤 nbsp;Embryo- genic callus浸泡法 nbsp;Colchicine immersion 0.01 24 h 18 8 3 0 16.67 0 3 0 0 0 48 h 7 5 0 1 0 20.00 0 0 0 1 72 h 2 6 0 2 0 33.33 0 2 0 0 0.05 24 h 25 15 2 1 8.00 6.67 1 1 1 0 48 h 20 8 5 0 25.00 0 1 0 4 0 72 h 5 10 1 4 20.00 40.00 1 3 0 1 0.10 24 h 13 25 0 12 0 48.00 0 8 0 4 48 h 4 7 1 2 25.00 28.57 1 1 0 1 72 h 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 混培法 nbsp;Medium supplement with colchicine 0.05 10 d 10 14 2 0 20.00 0 2 0 0 0 20 d 5 9 0 4 0 44.44 0 2 0 2 30 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.10 10 d 9 13 2 1 22.22 7.69 1 1 1 0 20 d 7 3 3 1 42.85 33.33 2 1 1 0 30 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.50 10 d 4 6 1 2 25.00 33.33 0 1 1 1 20 d 4 1 2 1 50.00 100.00 2 0 0 1 30 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 总计 nbsp;Total 133 134 22 31 nbsp; 14 20 8 11 利用根尖染色体鉴定法对经秋水仙素处理后得到的再生植株进行鉴定（图 1） ，细叶百合共得到214 株二倍体（ 2n 2x 24） ， 19 株四倍体（ 2n 4x 48）和 34 株非整倍体；兰州百合共获得再生植株 28 株，其中 6 株四倍体， 10 株非整倍体，多倍体诱变率为 57.14。 nbsp;2.2 nbsp;经体细胞胚发生的再生植株与多倍体植株的 ISSR 分析 nbsp;在细叶百合中筛选出了 8 个最为合适的引物为 A59、 A37、 A50、 A26、 UBC873、 UBC820、 UBC857和 UBC845， 兰州百合筛选出了 8 个最为合适的引物为 A37、 UBC815、 UBC843、 UBC844、 UBC857、UBC873、 UBC825 和 UBC835。每个引物检测 10 株体细胞胚再生植株，观察多态性条带。 nbsp;在未经加倍处理的两种百合体胚再生植株中共检测 3 270 条带，基本上没有出现变异条带，说明两种百合体细胞胚发生的遗传较为稳定（图 2） 。 nbsp;Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1140 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1136– 1146. 图 1 nbsp;细叶百合和兰州百合染色体加倍情况 nbsp;Fig. 1 nbsp;Chromosome doubling in Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor 图 2 nbsp;细叶百合和兰州百合二倍体植株体细胞胚的 ISSR 检测 nbsp;M 2 000 bp DNA marker； 1母株； 2 11再生植株。 nbsp;Fig. 2 nbsp;The ISSR detection for somatic embryogenesis in Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor M 2 000 bp DNA marker； 1 Mother plant； 2– 11 Regenerates plant. 孙红梅，付麟岚，王志平，盖美竹，王春夏 . 基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 6 1136– 1146. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1141 在经秋水仙素处理的多倍体植株中， 细叶百合中选取的 8 个 ISSR 引物对平均每个引物对扩增 7个条带。结果表明，与对照植株相比变异植株的 ISSR 检测条带发生了变化（图 3） ，总检测条带数为 336 条，变异植株的 ISSR 条带变异率为 15.48。 nbsp;兰州百合中选取的 8 个 ISSR 引物对平均每个引物对扩增 6.63 个条带。多倍体植株的检测结果中同样出现了多态性条带（图 3） 。总检测条带数为 318 条， 31 条具有多态性，诱变植株的 ISSR 多态性条带百分率为 9.75。 nbsp;图 3 nbsp;细叶百合和兰州百合多倍体植株 ISSR 检测 nbsp;M 2 000 bp DNA marker； C对照植株； P染色体加倍植株。 nbsp;Fig. 3 nbsp;ISSR used for early detection of polyploids in Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor M 2 000 bp DNA marker； C Control plants； P Chromosome doubling plants. 2.3 nbsp;四倍体植株的形态学和解剖学观察 nbsp;观察在相同培养条件下的细叶百合和兰州百合二倍体与四倍体试管苗，发现四倍体植株均呈现鳞茎增大、叶片宽厚、叶柄变粗、叶色加深的现象（图 4） 。两种百合二倍体与四倍体植株的气孔频度和大小差异显著，通过显微镜微尺测量发现，两种百合四倍体植株的气孔孔径、保卫细胞长度均显著大于二倍体植株，气孔频度均小于二倍体植株（表 2，图 5） 。 nbsp;Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1142 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1136– 1146. 表 2 nbsp;两种百合二倍体植株（ 2x）与四倍体植株（ 4x）形态学及气孔、保卫细胞的比较 nbsp;Table 2 nbsp;The morphological feature， stomata and guard cell in the diploid plant and the tetraploid plant of both Lilium species 材料 nbsp;Sample 倍性 nbsp;Ploidy 鳞茎周径 /mm nbsp;Bulb circumferential diameter 鳞片厚 /mm Scale thickness 叶片宽 /mm Leaf width 叶柄直径 /mm Petiole diameter 细叶百合 Lilium pumilum DC. Fisch. 4x 25.89 1.21 A nbsp;2.25 0.24 A nbsp;5.06 0.11 A nbsp;1.89 0.60 A 2x 12.86 0.43 B 1.25 0.15 B 2.37 0.18 B 1.03 0.22 B 兰州百合 Lilium davidii var. unicolor 4x 23.60 0.36 A nbsp;2.64 0.05 A nbsp;6.26 0.17 A nbsp;2.06 0.16 A nbsp;2x 11.57 0.37 B 1.61 0.14 B 2.84 0.12 B 1.14 0.10 B 材料 nbsp;Sample 倍性 nbsp;Ploidy 气孔长 /μm Stomatal length 气孔频度 nbsp;Stomatal frequency 保卫细胞长 /μm Guard cell length 保卫细胞宽 /μm Guard cell width 细叶百合 Lilium pumilum DC. Fisch. 4x 67.47 2.05 A 10.00 0.58 A nbsp;118.62 2.32 A nbsp;16.82 0.64 A 2x 39.48 1.30 B 17.67 0.88 B 78.58 1.15 B 15.94 0.36 B 兰州百合 Lilium davidii var. unicolor 4x 51.67 2.56 A 21.67 0.67 A nbsp;93.95 2.39 A nbsp;20.66 0.86 A nbsp;2x 22.97 1.85 B 21.67 0.67 B 62.82 1.54 B 17.49 0.48 B 图 4 nbsp;细叶百合与兰州百合二倍体植株（左）和四倍体植株（右）比较 nbsp;Fig. 4 nbsp;The comparison between diploid plant（ left） and tetraploid plant（ right） of Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor 孙红梅，付麟岚，王志平，盖美竹，王春夏 . 基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 6 1136– 1146. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1143 图 5 nbsp;细叶百合和兰州百合二倍体植株与四倍体植株在 40 镜下的气孔情况 nbsp; nbsp;Fig. 5 nbsp;The stomata of colchicine-induced diploid plants and the tetraploid under 40 mirror nbsp;of Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor nbsp;叶绿素含量测定结果表明，细叶百合和兰州百合四倍体植株的叶绿素含量分别为（ 1.490 0.039）和（ 0.838 0.110） mg g-1，极显著高于二倍体植株的（ 0.940 0.108）和（ 0.749 0.002）mg g-1。四倍体植株移栽后均能正常存活并生长，且比二倍体植株更易存活，长势更加健壮（图 6） 。 nbsp;图 6 nbsp;细叶百合和兰州百合二倍体植株与四倍体植株移栽比较 nbsp;Fig. 6 nbsp;The comparison of transplanting Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium davidii var. unicolor Sun Hongmei， Fu Linlan， Wang Zhiping， Gai Meizhu， Wang Chunxia. Polyploidy induction and identification of Lilium pumilum and Lilium davidii var. unicolor based on somatic embryogenesis. 1144 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1136– 1146. 3 nbsp;讨论 nbsp;随着组织培养技术的发展，近年来以植物体细胞胚为外植体诱导植株多倍体的研究逐渐增多。体细胞胚作为诱导受体除了可以获得同源多倍体外，还可以提高植株再生效率，缩短诱导周期（ Sattler et al.， 2016） 。 秋水仙素结合组织培养诱导百合多倍体的处理方法主要包括浸泡法 （ He et al.，2016a）和混培法（ Leila et al.， 2014）。本研究中发现，在不同浓度秋水仙素和不同处理方式下，都可以获得两种百合的染色体加倍植株，且以胚性愈伤组织为外植体的诱导效果更好。杨英杰等（ 2013）以细叶百合种子为受体，使用 0.05、 0.1和 0.2的秋水仙素浸泡处理后成功获得了多倍体植株，并发现在使用 0.2的秋水仙素浸泡处理 48 h 后，所有种子死亡；当使用 0.1秋水仙素处理 24 h 时，诱变率（ 30）相对较高。本研究中发现，相同处理浓度和处理时间，以胚性愈伤组织为受体的多倍体诱变率更高。 nbsp;本试验中，两种野生百合多倍体植株均出现小鳞茎增大、叶片增厚变宽、叶色加深、气孔及保卫细胞增大、叶绿素含量升高等现象，符合多倍体植株器官“巨大”性的特点。百合鳞茎是由许多鳞片按照一定规律生长抱合而成的一种变态茎，鳞片呈现为花瓣状结构。百合鳞片的生长具有向线性，即在轮生过程中都向中心茎秆或生长锥慢慢偏转（戈振扬 nbsp;等， 2013）。本研究中发现细叶百合个别四倍体植株小鳞茎的外层鳞片向外扩张，成不抱合状态，不符合正常百合鳞片的向线生长趋势，而兰州百合多倍体中未发现此现象。相对于整数倍加倍的植株来说，非整倍体植株的形态变异更为复杂多样。 nbsp;植株离体发育过程中产生的变异多数从外观上难以分辨。近几年发展起来的分子标记技术成为离体再生植株的遗传稳定分析的热门技术手段。 ISSR（ Inter Simple Sequence Repeat）是分子标记技术最常用的一种分子遗传标记（ Khateeb et al.， 2013），被广泛用于植物体细胞胚的遗传稳定性检测（ Bekheet et al.， 2015），如番石榴（ Rai et al.， 2012）、草决明（ Naz et al.， 2016）、羽衣甘蓝（ Leroy et al.， 2000）和香蕉（李艳娜 nbsp;等， 2010）等。本研究中，利用基于 PCR 的 ISSR 技术检测体细胞胚发生过程中的遗传变化，在再生植株中基本没有出现变异条带，证实了通过体细胞胚发生途径再生可以降低遗传变异（ Hassan et al.， 2015），同时也为以体胚为材料能够诱导稳定遗传的多倍体植株提供了佐证。 nbsp;与形态学观察相比，分子标记技术在遗传稳定性鉴定中可信度更高（ Mallick et al.， 2017） 。 ISSR技术已经被成功应用到了百合 （ Wang et al.， 2009） 、 马铃薯 （ Mcgregor et al.， 2000） 和葫芦 （ Marzougui et al.， 2000）等植物的多倍体遗传多样性分析中。本研究中，两种百合的多倍体植株在不同 ISSR引物的检测下均检测到了多态性条带。在前期二倍体植株体细胞胚遗传稳定性检测的基础上，从分子水平层面上说明了加倍植株在遗传上均发生了变化， 且这种遗传变化是由于人工诱导加倍引起的，而非体细胞胚发生过程中产生的变异。 nbsp;References Alsiņa I， Duma M， Dubova L， Šenberga A， Daģis S. 2016 Comparison of different chlorophylls determination s for leafy vegetables. Agronomy Research， 14 2 309– 316. Bekheet S A， Gabr A M M， Reda A A， El-Bahr M K. 2015. Micropropagation and assessment of genetic stability of in vitro raised jojoba（ Simmondsia chinensis Link.） plants using SCoT and ISSR markers. Plant Tiss Cult Biotech， 25 2 165– 179. Cabral G B， Carneiro V T C， Dusi D， Martinelli A P. 2016. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Brachiaria brizantha. Meth Mol Bio，1359 395– 402. 孙红梅，付麟岚，王志平，盖美竹，王春夏 . 基于体细胞胚发生的细叶百合和兰州百合多倍体诱导及鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 6 1136– 1146. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1145 Eeckhaut T G R， Werbrouck S P O， Leus L W H， Debergh C P. 2004. Chemically induced polyploidization in Spathiphyllum wallisii Regel through somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss Org Cul， 78 3 241– 246. Endemann M， Hristoforoglu K， Stauber T， Wilhelm E. 2001. Assessment of age-related polyploidy in Quercus robur L. somatic embryos and regenerated plants using DNA flow cytometry. Bio Plantarum， 44 3 339– 345. Ge Zhen-yang， Jiang Li-min， Yu Ying-jie， Li Peng， Yi Huai-feng， Li Li-cheng. 2013. Growth modelling an/p