‘甜蜜蓝宝石’葡萄组培技术研究.pdf

中 国果菜 China Fruit tissue culture rapid propagation technology 处理 消毒试剂 消毒时间 min T1 1 NaClO 15 T2 1 NaClO 20 T3 3 NaClO 15 T4 3 NaClO 20 T5 0 1 HgCl 2 12 T6 0 1 HgCl 2 15 栽培生理 周闰 等 甜蜜蓝宝石 葡萄组培技术研究 63 滤 纸吸去表面多余水分 然后切去两端褐化的伤口 将 消毒过的材料切成长 1 0 cm 左右带一个腋芽的茎段 正 插于启动培养基上进行培养 启动培养基为 1 2 MS 不 添加任何激素 每瓶接种 1 个茎段 每个处理接种 20 个 茎段 设 3 次重复 设置培养室条件如下 保持温度 26 左右 相对湿度为 40 60 每日光照 12 h 15 d 后 统 计接种材料的污染率 褐变率和成活率 计算方法分别 见公式 1 2 3 用以确定最佳的消毒方法 污染率 污染茎段数 接种茎段 数 100 1 褐变率 褐变茎段数 接种茎段 数 100 2 成活率 成活茎段数 接种茎段 数 100 3 1 2 4 快繁体系的建立 1 初代培养 采用筛选出的最佳消毒方法进行消毒 把消毒后的 茎段接种于初代培养基上 设置四个配方 分别记作 PC1 PC2 PC3 PC4 培养基成分见表 2 每瓶接种 1 个 茎段 每个处理接种 30 个茎段 3 次重复 培养条件为保 持温度 26 左右 相对湿度为 40 60 每日光照 12h 30 d 后 记录生长情况并统计萌芽率 萌芽率按照公式 4 计算得出 萌芽率 A T 100 4 式中 A为萌芽的茎段总数 T为接种的茎段总数 表 2 不同初代培养基配方 Table 2 Different ulations of primary mediums 2 增殖培养 将初代培养腋芽生长最好的培养基作为筛选出的 初代培养基配方 接种 50 d 后 当该培养基上腋芽生长 至株高 4 5 cm 时 将其剪下 去掉叶片 从中剪取健康 饱满的处在中间节位的单芽茎段 长度约 0 5 1 cm 做 到茎段基本一致 然后接种于增殖培养基上 每瓶接种 3 个茎段 培养基设置 5 个配方 分别记作 PZ1 PZ2 PZ3 PZ4 PZ5 培养基成分见表 3 每个处理接种 15 个茎段 设 3 次重复 培养条件同初代培养 45 d 后统计萌芽率 平均株高 增殖系数和生长情况 其中增殖系数按照公 式 5 计算 增殖系数 B W 100 5 式中 B为可用于下次继代的茎段总数 W为接种的 茎段总数 表 3 不同增殖培养基配方 Table 3 Different ulations of breeding mediums 3 生根培养 增殖培养 45 d 后 将腋芽生长最好的培养基作为筛 选出的增殖培养基配方 将其中生长的腋芽剪下去掉 叶片 从中剪取健康饱满的中间节位的单芽茎段 长度 0 5 1 cm 做到茎段基本一致 接种于生根培养基 培养 基设置 5 个配方 分别记作 PT1 PT2 PT3 PT4 PT5 培 养基成分见表 4 每瓶接种 5 个茎段 每个处理接种 20 个茎段 设 3 次重复 培养条件与增殖培养条件一致 50d 后观察生长情况 统计萌芽率 生根率 主根密度及平均 根长 其中生根率按照公式 6 计算得出 生根率 C W 100 6 式中 C为生根的茎段总数 W为接种的茎段总数 表 4 不同生根培养基配方 Table 4 Different ulations of rooting mediums 4 炼苗和移栽 生根培养 50 d 以上 当生根良好的组培苗株高达到 处理 配方 PC1 1 2 MS PC2 1 2 MS 6 BA0 5 mg L IBA0 1 mg L PC3 1 2 MS 6 BA1 0 mg L IBA0 1 mg L PC4 MS 处理 配方 PZ1 1 2 MS 6 BA0 1 mg L IBA0 05 mg L PZ2 1 2 MS 6 BA0 3 mg L IBA0 05 mg L PZ3 1 2 MS 6 BA0 5 mg L IBA0 05 mg L PZ4 1 2 MS 6 BA0 3 mg L NAA0 05 mg L PZ5 1 2 MS 处理 配方 PT1 1 4 MS IBA0 1 mg L PT2 1 4 MS IBA0 5 mg L PT3 1 4 MS IBA1 0 mg L PT4 1 4 MS NAA0 5 mg L PT5 1 2 MS 栽培生理中国果菜64 5 7 cm 带 5 7 个叶片时 将试管苗置于炼苗室 先拧 松瓶盖炼苗 2 3 d 再完全打开瓶口炼苗 7 10 d 待茎 秆颜色加深 叶片发亮时即可出瓶移栽 将植株小心取 出 用自来水洗净组培苗根部的培养基 准备配制好的 基质 含椰糠 草炭土 珍珠岩和蛭石四种成分 比例为 2 1 1 1 用多菌灵溶液搅拌至基质土坨不散 分装 至营养钵 直径约 6 5 cm 然后移栽组培苗 将苗子置于 育苗箱中 盖上盖子保湿 然后保持温度在 25 左右 注 意通风 防止基质发霉 当出现新生叶 1 2 片时 打开盖 子通风 2 d 将苗再次转入营养袋 观察成活情况 1 3 统计分析方法 采用 Excel 2007 软件和 SPSS 22 0 软件进行数据处 理及分析 2 结果与分析 2 1 外植体最佳消毒方法 用次氯酸钠消毒后 外植体易出现褐化现象且影 响腋芽的萌发 而用升汞消毒则颜色较正常 由表 5 可 知 0 1 升汞消毒的表现优于 1 3 次氯酸钠 茎段外 植体的最佳消毒处理是 T6 即 0 1 升汞消毒 15 min 外 植体污染率 褐变率和成活率分别是 46 7 13 3 和 40 0 因此 外植体的消毒方法采用先用 75 酒精消毒 40 s 再用 0 1 升汞消毒 15 min 表 5 外植体最佳消毒方法的筛选 Table 5 Selection of the best for disinfection of explants 注 同列不同小写字母表示处理间差异达显著水平 P 0 05 下表同 2 2 不同初代培养基对茎段诱导的影响 茎段外植体接种到不同初代培养基上 30 d 后统计 茎段外植体萌芽率 见表 6 结果表明 外植体在四种培 养基配方上都有萌芽 但是在不添加任何激素的 1 2 MS 上的表现最好 萌芽率达到 57 8 新芽生长正常 以 1 2 MS 为基本培养基的另两个配方 其中添加了 6 BA 和 IBA两种激素 茎段基部产生较多愈伤组织 且新芽生长 不正常 后期出现玻璃化现象 在不添加任何激素的 MS 培养基上 茎段基部膨大明显 影响腋芽的生长 导致出 芽慢且有玻璃化现象 所以确定最佳初代培养基配方为 1 2 MS 30 g L蔗糖 6 5 g L琼脂 表 6 不同初代培养基茎段诱导情况 Table 6 Stem segment induction in different primary mediums 2 3 不同增殖培养基对茎段培养的影响 增殖培养过程中 5 种培养基上的茎段生长表现各 不相同 第 45 天统计情况 结果见表 7 以不添加任何激 素的 1 2 MS增殖效果最好 增殖系数高达 5 2 显著高于 其他处理 基本不产生愈伤 生长正常 还能同时生根 在 PZ1 PZ2 和 PZ3 三种培养基上 茎段基部愈伤率都达到 100 随着 6 BA浓度的提高 萌芽率逐渐升高 但是愈 伤组织越来越大 新芽叶片短小 节间短缩 且部分出现 丛生芽及玻璃化的现象 PZ4 中生长激素用 NAA 替换 IBA 但是其产生的愈伤组织更大叶片小且偏黄 新芽 生长不正常 说明该配方不合适 表 7 不同增殖培养基的培养效果 Table 7 Culture effect of different propagation medium 2 4 不同生根培养基对葡萄生根的影响 生根培养 50 d 后 随机选取 10 株苗进行统计 结果 见表 8 见下页 甜蜜蓝宝石 葡萄品种容易生根 不添 加任何激素的 1 2 MS培养基生根率也很高 但是新梢茎 秆纤细 不利于移栽 添加不同浓度的生长素后均有生 根 其中 1 4 MS培养基中添加 IBA浓度为 0 1 mg L时 处理 污染率 褐变率 成活率 T1 75 0 18 0 a 6 7 2 9 b 18 3 10 4 b T2 66 7 7 6 ab 11 7 2 9 b 21 7 7 6 b T3 65 0 5 0 ab 10 0 5 0 b 25 0 10 0 ab T4 60 0 13 2 ab 21 7 5 8 a 18 3 7 6 b T5 55 0 13 2 ab 8 3 2 9 b 36 7 10 4 ab T6 46 7 2 9 b 13 3 2 9 b 40 0 10 0 a 处理 萌芽率 生长情况 PC1 57 8 8 4 a 基部产生少量愈伤 新芽生长正常 PC2 50 0 5 8 ab 基部产生较多愈伤 新芽出现少量玻璃化现象 PC3 41 1 10 7 b 基部产生大量愈伤 新芽出现较多玻璃化现象 PC4 45 6 5 1 ab 基部膨大明显 新芽出芽慢且有少量玻璃化现象 栽培生理 周闰 等 甜蜜蓝宝石 葡萄组培技术研究 培养基编号 萌芽率 平均株高 cm 增殖系数 PZ1 57 8 7 7 c 3 2 0 4 b 1 8 0 2 c PZ2 86 7 23 1 ab 2 5 0 2 c 2 0 0 2 c PZ3 95 6 3 9 a 2 2 0 3 c 1 5 0 5 c PZ4 71 1 10 2 bc 3 5 0 6 b 2 6 0 4 b PZ5 88 9 3 8 ab 6 0 0 3 a 5 2 0 1 a 65 即 培养基 PT1 效果最好 萌芽率达到 91 7 生根率达到 88 3 生长正常 随着 IBA 浓度逐渐提高 虽然新梢茎 秆更加粗壮 但基部产生的愈伤更多 导致萌芽率及生 根率逐渐降低 新梢生长过慢 而添加 0 5 mg L的 NAA 则出现部分只长根不萌芽的现象 萌芽率只有 30 生 根率只有 55 且根为气生根 愈伤组织大而疏松 2 5 炼苗移栽情况 试管苗驯化时 保持温度 20 28 湿度在 80 左 右 让试管苗逐渐适应外界的环境 不能操之过急 本试 验采用配制好的基质土用于幼苗的驯化 再次移栽至营 养袋时 已经产生较多新根 在营养袋生长两周后 统计 成活率高达 90 3 讨论 外植体消毒作为组织培养的第一步 具有关键作 用 外植体的生长发育情况及对其消毒时间的长短 对 发芽率尤为重要 因此寻求最佳的消毒药剂及其浓度和 时间的组合 控制外植体污染和褐变率 是消毒环节的 重要问题 10 11 本试验筛选出了较优的消毒方法 但外植 体污染率太高 萌芽率过低 可能因为取材于野外的环 境 且取材季节过晚 雨季天气来临 病菌种类多变且繁 殖活跃 12 导致难以消毒 虽然通过延长消毒时间可以降 低部分污染率 但同时也增加了死亡率 最终萌芽率也 不高 所以进一步探索合适的取材时间很有必要 植物激素具有刺激形成层细胞的分裂 诱导愈伤组 织 不定芽和不定根的形成等生理作用 缺乏或者过多 都会对植物生长产生不利影响 7 植物组织培养增殖过 程中 可以通过腋芽产生不定芽 丛生芽 和腋芽萌发成 新梢两种方式扩繁 生长素类物质在两种方式中均是必 需的 而细胞分裂素类物质在促发丛生芽的方式中是必 需的 但在腋芽萌发成新梢的过程中不是必需的 13 15 但 本试验增殖培养过程 在添加了激素的培养基中 因为基 部产生较多愈伤 抑制了发根和抽茎 芽的生长受到抑 制 生长缓慢 或者部分产生了丛生芽 但是难以继续生 长 并出现玻璃化现象 所以选择不添加任何激素的 1 2 MS基本培养基作为增殖培养基 以腋芽萌发成新梢的 方式进行扩繁 不产生丛生芽 继代增殖系数相对较低 但组培苗生长健壮 多次继代培养后无玻璃化 褐化现 象 16 17 生根培养过程中 随着添加 IBA 浓度的逐步升 高 基部产生的愈伤也不断增多 导致萌芽率及生根率 逐渐降低 新梢生长减缓 但是在不添加生长激素的培养 基中 新梢茎秆纤细 不利于移栽 所以选择添加 0 1 mg L 的 IBA进行生根培养最合适 这说明一定浓度的外源生 长素如 IBA IAA可促进葡萄根的发育和试管苗生长 但 浓度过高诱导产生大量愈伤组织 则会抑制试管苗的生 长 18 21 与大部分研究一致 营养物质对组培苗的生长状况影响很大 20 虽然本 试验中茎段可以一次成苗 一次成苗即将继代培养和生 根培养同时进行 既能加快试管苗的培育速度 又能减少 劳动力的消耗 具有很大优势 但因为采用增殖培养基配 方同步生根的苗子茎秆过于纤细 不利于炼苗移栽 而采 用生根培养基配方一次成苗 则增殖太慢 因为生根培养 后的瓶苗茎秆过于老化 难以再增殖 而用两次成苗法 即用增殖培养基先增殖 然后再转接到生根培养基上进 行生根培养 则起到了壮苗的作用 能有效提高移栽的成 活率 且培养基大量元素的用量减半 在生产上更有成本 优势 所以本试验增殖和生根分两步完成 这与大部分 研究一次成苗的结论不一致 21 分析原因可能是培养基 的配方需要调整 也可以尝试缩短生根培养的时间 及时 转接继代 用以提高增殖率 今后仍需进一步探索 培养基编号 萌芽率 生根率 主根密度 条 株 平均根长 cm 生长情况 PT1 91 7 7 6 a 88 3 2 9 ab 3 6 0 3 cd 3 0 0 3 b 植株茎秆较粗壮 基部产生的愈伤组织很少 PT2 83 3 12 6 ab 83 3 10 4 ab 4 2 0 2 bc 2 8 0 2 b 植株茎秆较粗壮 基部产生较多愈伤组织 植株生长较慢 PT3 71 7 10 4 b 73 3 7 6 b 5 5 0 6 a 2 5 0 4 b 植株茎秆粗壮 基部产生较多愈伤组织 植株生长过慢 PT4 30 0 10 0 c 55 0 8 7 c 4 5 0 4 b 1 0 0 4 c 植株玻璃化现象较重 基部愈伤组织大而疏松 PT5 88 3 2 9 ab 90 0 10 0 a 3 3 0 4 d 5 0 0 9 a 新梢茎秆纤细 表 8 不同生根培养基的培养效果 Table 8 Culture effect of different rooting medium 栽培生理 中国果菜 66 4 结论 甜蜜蓝宝石 葡萄的组织培养包括茎段外植体消 毒 启动培养 增殖培养 生根培养以及炼苗移栽环节 本研究发现 甜蜜蓝宝石 外植体的最佳消毒方法是先 采用 75 酒精消毒 40 s 再用 0 1 升汞消毒 15 min 最 佳初代培养基为 1 2 MS 30 g L蔗糖 6 5 g L琼脂 萌芽 率达到 57 8 1 2 MS增殖培养效果最好 增殖培养 45 d 增殖系数高达 5 2 生根培养基以 1 4 MS IBA0 1 mg L 效果最好 生根培养 50 d 生根率达到 88 3 新芽茎秆 较为粗壮 生长正常 炼苗时 保持温度 20 28 湿度 在 80 左右 成活率高达 90 该组培繁殖体系可用于 甜蜜蓝宝石 葡萄新品种的繁育 有一定的潜在应用前 景 为其商业化生产提供了理论参考 参考文献 1 刘凤之 中国葡萄栽培现状与发展趋势 J 落叶果树 2017 49 1 1 4 2 吴昊 甜蜜蓝宝石葡萄的高产栽培技术 J 河北农业 2019 10 44 47 3 沈传进 王利民 张平 等 鲜食葡萄组织培养快速繁育系 统的建立 J 河北农业科学 2011 15 7 16 21 4 沈传进 对乌海市葡萄产业发展的再认识 J 华北农学报 2006 S3 133 136 5 蔡文博 段虹 王军 等 4 个鲜食葡萄品种组培快繁体系的 建立 J 核农学报 2019 33 2 248 254 6 曹孜义 刘国民 实用植物组织培养技术教程 M 兰州 甘 肃科学技术出版社 1998 17 20 7 李国树 邱璐 徐成东 等 葡萄组织培养快速繁殖体系研 究 J 北方园艺 2011 9 134 136 8 曾建国 吴雪梅 巨峰葡萄组培快繁过程中初代培养基的 筛选 J 现代园艺 2010 7 4 7 9 刘娜 许轲 张文 等 四个酿酒葡萄品种组培快繁体系的 初建 J 植物生理学报 2013 49 10 1071 1076 10 莫银屏 徐丰 石雪晖 等 湘酿 1 号刺葡萄离体快繁技术 试验 J 中外葡萄与葡萄酒 2015 2 26 28 11 温鹏飞 王蓓 张建成 等 次氯酸钠对葡萄叶片组培褐变 率的影响 J 山西农业科学 2012 40 6 571 574 12 苏玲 宫磊 尹向田 等 贵妃玫瑰葡萄组培技术探究 J 安 徽农业科学 2020 48 8 51 53 65 13 王冬梅 黄学林 黄上志 细胞分裂素类物质在植物组织培 养中的作用机制 J 植物生理学通讯 1996 5 373 377 14 洪森荣 尹明华 香果树带芽茎段不定芽高频增殖的优化 J 核农学报 2010 24 3 532 536 15 蔡文博 段虹 王军 等 4 个鲜食葡萄品种组培快繁体系的 建立 J 核农学报 2019 33 2 248 254 16 冯发文 田群芳 巨峰葡萄组织培养快繁技术研究 J 落叶 果树 2011 43 2 6 8 17 曹孜义 杨德龙 梁庆丰 等 内 39 号葡萄株系的离体快繁 技术研究 J 果树学报 2002 6 427 429 18 郑平生 李向东 李国梁 几种葡萄砧木组培快繁生根研究 J 北方园艺 2014 3 101 103 19 常宁 侯艳霞 卢爱英 草莓脱毒苗继代和生根培养基优化 J 中国果菜 2022 42 8 73 76 20 陶阿丽 曹殿洁 华芳 等 植物组织培养技术研究进展 J 长江大学学报 自科版 2018 15 18 31 35 21 潘学军 张文娥 唐冬梅 等 无核葡萄离体快繁技术研究 J 中国南方果树 2007 2 44 46 栽培生理 周闰 等 甜蜜蓝宝石 葡萄组培技术研究 67