壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响

p中国农业大学学报２０１８，２３（１）５４－６２ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＩＮＡＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＨＴＴＰ∥ＺＧＮＹＤＸＸＢ．ＩＪＯＵＲＮＡＬＳ．ＣＮＤＯＩ１０．１１８４１／Ｊ．ＩＳＳＮ．１００７－４３３３．２０１８．０１．０７壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响董春娟李亮张志刚王玲玲尚庆茂＊（中国农业科学院蔬菜花卉研究所／农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室／环渤海湾地区设施蔬菜优质高效生产协同创新中心，北京１０００８１）摘要为明确壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，以添加壳聚糖的草炭、蛭石、珍珠岩为基质，进行黄瓜穴盘育苗试验，测定幼苗生长指标，并采用４５４焦磷酸测序技术测定穴盘苗根际细菌的种群变化。结果表明基质添加壳聚糖可以显著促进黄瓜穴盘苗生长。添加壳聚糖使穴盘苗根际基质中细菌群落的ＡＣＥ、ＣＨＡＯ１和ＳＨＡＮＮＯＮ指数减小，ＳＩＭＰＳＯＮ指数增大，根际细菌群落的丰富度和多样性降低。序列分析表明，黄瓜穴盘苗根际基质中的细菌主要是丛毛单胞菌科ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属、假单胞菌科纤维弧菌属、黄色杆菌科ＤＯＫＤＯＮＥＬＬＡ属和草酸杆菌科ＭＡＳＳＩＬＩＡ属等。添加壳聚糖后，根际细菌如ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属、纤维弧菌属、根瘤菌属、ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ属、ＦＬＡＶＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ属等的相对丰度显著升高，这些细菌属多具有植物促生潜力；而食酸菌属、ＤＯＫＤＯＮＥＬＬＡ属、ＭＡＳＳＩＬＩＡ属、丰祐菌属、纤维单胞菌属等的相对丰度显著降低。可见，基质添加壳聚糖有利于根际有益细菌的选择性富集，改善黄瓜穴盘苗根际微生态环境，促进幼苗生长。关键词黄瓜；壳聚糖；基质；根际细菌；４５４测序中图分类号Ｓ１５４．３８＋１文章编号１００７－４３３３（２０１８）０１－００５４－０９文献标志码Ａ收稿日期２０１７－０３－１３基金项目国家自然科学基金项目（３１１７２００１）；公益性行业（农业）科研专项经费项目（２０１３０３０１４）；现代农业产业技术体系建设专项资金（ＣＡＲＳ－２５）；中国农业科学院科技创新工程（ＣＡＡＳ－ＡＳＴＩＰ－ＩＶＦＣＡＡＳ）第一作者董春娟，副研究员，主要从事蔬菜种苗发育调控研究，Ｅ－ＭＡＩＬＤＯＮＧＣＨＵＮＪＵＡＮ＠ＣＡＡＳ．ＣＮ通讯作者尚庆茂，研究员，主要从事蔬菜种苗发育调控及繁育技术研究，Ｅ－ＭＡＩＬＳＨＡＮＧＱＩＮＧＭＡＯ＠ＣＡＡＳ．ＣＮＥＦＥＣＴＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＤＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳＤＯＮＧＣＨＵＮＪＵＡＮ，ＬＩＬＩＡＮＧ，ＺＨＡＮＧＺＨＩＧＡＮＧ，ＷＡＮＧＬＩＮＧＬＩＮＧ，ＳＨＡＮＧＱＩＮＧＭＡＯ＊（ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＯＦＶＥＧＥＴＡＢＬＥＳＡＮＤＦＬＯＷＥＲＳ／ＫＥＹＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＯＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＡＮＤＧＥＮＥＴＩＣＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴＯＦＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＡＬＣＲＯＰＳ，ＭＩＮＩＳＴＲＹＯＦＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ／ＣＯＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＣＥＮＴＥＲＯＦＰＲＯＴＥＣＴＥＤＶＥＧＥＴＡＢＬＥＳＵＲＲＯＵＮＤＢＯＨＡＩＧＵＬＦＲＥＧＩＯＮ，ＣＨＩＮＥＳＥＡＣＡＤＥＭＹＯＦＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＢＥＩＪＩＮＧ１０００８１，ＣＨＩＮＡ）ＡＢＳＴＲＡＣＴＩＮＯＲＤＥＲＴＯＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＥＴＨＥＥＦＥＣＴＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＩＣＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＯＭＭＵＮＩＴＹＡＮＤＤＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳ，ＣＨＩＴＯＳＡＮＷＡＳＡＰＰＬＩＥＤＴＯＴＨＥＳＵＢＳＴＲＡＴＥ，ＷＨＩＣＨＷＡＳＣＯＭＰＯＳＥＤＢＹＰＥＡＴＭＯＳＳ，ＶＥＲＭＩＣＵＬＩＴＥＡＮＤＰＥＲＬＩＴＥ．ＴＨＥＧＲＯＷＴＨＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＳＥＥＤＬＩＮＧＳＷＡＳＡＳＳＡＹＥＤ，ＡＮＤＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＤＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳＷＥＲＥＤＥＴＥＣＴＥＤＢＹ４５４ＰＹＲＯＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ．ＴＨＥＲＥＳＵＬＴＳＳＨＯＷＥＤＴＨＡＴＣＨＩＴＯＳＡＮＰＲＯＭＯＴＥＤＴＨＥＧＲＯＷＴＨＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＳＥＥＤＬＩＮＧＳ，ＤＥＣＲＥＡＳＥＴＨＥＡＣＥ，ＣＨＡＯ１ＡＮＤＳＨＡＮＮＯＮＩＮＤＥＸＥＳ，ＡＮＤＩＮＣＲＥＡＳＥＴＨＥＳＩＭＰＳＯＮＩＮＤＥＸ，ＩＮＤＩＣＡＴＩＮＧＴＨＡＴＣＨＩＴＯＳＡＮＲＥＤＵＣＥＤＴＨＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＲＩＣＨＮＥＳＳＡＮＤＤＩＶＥＲＳＩＴＹＩＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＩＣＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳ．ＴＨＥＭＡＪＯＲＢＡＣＴＥＲＩＡＩＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＩＣＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳＩＮＣＬＵＤＥＤＰＥＬＯＭＯＮＡＳ，ＣＥＬＶＩＢＲＩＯ，ＤＯＫＤＯＮＥＬＡ，ＡＮＤＭＡＳＳＩＬＩＡ．ＡＦＴＥＲＣＨＩＴＯＳＡＮＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ＴＨＥＲＥＬＡＴＩＶＥＡＢＵＮＤＡＮＣＥＳＯＦＳＯＭＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＧＥＮＥＲＡ（ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ，ＣＥＬＶＩＢＲＩＯ，ＲＨＩＺＯＢＩＵＭ，ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ，ＦＬＡＶＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ，ＥＴＣ．）ＷＥＲＥＳＩＧＮＩＦＩＣＡＮＴＬＹＩＮＣＲＥＡＳＥＤ．ＭＯＳＴＯＦＴＨＥＳＥＢＡＣＴＥＲＩＡＷＥＲＥＰＯＴＥＮＴＩＡＬＰＬＡＮＴＧＲＯＷＴＨ－ＰＲＯＭＯＴＩＮＧＢＡＣＴＥＲＩＡ．ＴＨＥＲＥＬＡＴＩＶＥＡＢＵＮＤＡＮＣＥＳＯＦＡＣＩＤＯＶＯＲＡＸ，ＤＯＫＤＯＮＥＬＡ，ＭＡＳＳＩＬＩＡ，ＯＰＩＴＵＴＵＳＡＮＤＣＥＬＵＬＯＭＯＮＡＳＷＥＲＥＳＵＢＳＴＡＮＴＩＡＬＹＲＥＤＵＣＥＤ．ＩＮＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ，ＣＨＩＴＯＳＡＮＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＣＯＵＬＤＳＥＬＥＣＴＩＶＥＬＹＰＲＯＭＯＴＥＴＨＥＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮＯＦＢＥＮＥＦＩＣＩＡＬＢＡＣＴＥＲＩＡ，ＡＮＤＩＭＰＲＯＶＥＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＭＩＣＲＯ－ＥＣＯＬＯＧＩＣＡＬＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴ，ＡＮＤＴＨＥＲＥＢＹＰＲＯＭＯＴＥＴＨＥＧＲＯＷＴＨＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳ．ＫＥＹＷＯＲＤＳＣＵＣＵＭＢＥＲ；ＣＨＩＴＯＳＡＮ；ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ；ＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＢＡＣＴＥＲＩＡ；４５４ＰＹＲＯＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ第１期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响壳聚糖（ＣＨＩＴＯＳＡＮ，ＣＴＳ）是甲壳素脱乙酰基的产物，因其来源广泛、无毒无害、无残留，以及同生物体极好的兼容性，常被用作植物病害抑制剂、种衣剂、植物生长调节剂、农药载体等，在农业上广泛应用［１，２］。叶面喷施壳聚糖可以显著促进黄瓜、番茄等植株对营养物质的吸收，提高植株光合能力，促进根系细胞分生，促进植物生长［３－５］。作为土壤改良剂，壳聚糖可被土壤中微生物分解，活化土壤的Ｃ和Ｎ养分，且壳聚糖分子对土壤中微量元素ＦＥ、ＣＵ、ＭＮ和ＭＯ等具有螯合效应，可以提高土壤中微量元素的有效态养分［６］。然而，施用壳聚糖是否对植物根际微生态环境有所影响，尚未见报道。植物根际细菌多样性与植物生长发育密切相关［７］。一方面，根际有益细菌可以直接参与土壤营养元素的代谢循环，促进有机质分解，提高养分的有效性，或分泌多种促生长类激素直接促进植物生长，同时根际有益细菌还可以通过竞争营养或侵染位点，合成抗生素类物质或载铁蛋白等机制抑制根际病原细菌的繁殖，协助植物抵御病害，提高植物免疫力。另一方面，根际有害细菌通过分泌毒素、竞争营养物质等抑制植物生长，尤其是一些病原细菌，通过侵染植物的维管束，造成植物水分、养分运输中断，引起植物枯萎、根腐和猝倒等症状［７－８］。多数根际细菌难以在实验室条件下培养。二代测序技术的兴起，包括４５４焦磷酸测序、ＩＬＵＭＩＮＡ等平台为根际细菌探索提供了很好的途径，可以更加高效、准确地反映根际细菌的多样性信息［９］。黄瓜（ＣＵＣＵＭＩＳＳＡＴＩＶＵＳＬ．）种植以育苗移栽为主，且主要采用穴盘育苗方式。基质是穴盘育苗的重要组成部分，由于基质配制不科学、操作不规范等，常造成幼苗根际基质的微生态环境不良，苗期病害时有发生。添加生物活性物质改善基质的生物学特性，为幼苗提供良好的根际环境，对于黄瓜壮苗培育至关重要。本研究采用４５４焦磷酸高通量测序技术分析了基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，旨在从细菌多样性角度丰富壳聚糖的促生机制，为黄瓜穴盘苗根际调控和壮苗培育提供理论依据。１材料与方法１．１黄瓜穴盘苗培养供试黄瓜选用“中农８号”（Ｃ．ＳＡＴＩＶＵＳＬ．ＣＶ．ＺＨＯＮＧＮＯＮＧ８），由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。黄瓜种子经体积分数为５％的ＮＡＣＬＯ溶液表面消毒１０ＭＩＮ，无菌水冲洗５遍后，２８℃恒温培养箱中催芽。种子萌发后，选择发芽一致的种子播种于装有草炭∶蛭石∶珍珠岩（体积比为３∶１∶１）混合基质的５０孔穴盘中，每穴孔一粒种子。草炭购自北京大汉园景有限公司（ＫＬＡＳＭＡＮＮ，德国），草炭ＰＨ５．５～６．５，ＥＣ值２０５ＭＳ／Ｍ；蛭石和珍珠岩购自河北灵寿县腾达矿产品加工厂，粒径分别为１～３ＭＭ和２～６ＭＭ。基质中添加７．５Ｇ／Ｌ壳聚糖（ＣＴＳ，脱乙酰度８５％～９５％，国药集团化学试剂有限公司），以不加壳聚糖的基质作为对照（ＣＫ）。播种后覆盖１．０ＣＭ厚的蛭石，并充分浇水，直至穴盘底部排水孔有水滴出现。育苗试验于２０１５年４５月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所玻璃温室中进行，平均昼夜温度分别为（２５３）℃／（１５３）℃，自然光照强度（约３５０ΜＭＯＬ／（Ｍ２Ｓ））和光周期，平均相对湿度７５％～９５％。待黄瓜幼苗子叶平展后，每隔１Ｄ使用“花多多”水溶速效复合肥（２０－１０－２０，ＴＨＥＳＣＯＴＴＳＣＯＭＰＡＮＹ，ＵＳＡ）溶液进行追肥，施肥氮（Ｎ）浓度为５０ＭＧ／Ｌ，至第一真叶展开后每隔１Ｄ施用１００ＭＧ／Ｌ“花多多”水溶肥，施用量为１Ｌ／穴盘，施肥与灌水交替进行。每个处理设３次重复，每重复４个穴盘。１．２黄瓜幼苗生长指标测定播种后２８Ｄ，每处理每重复随机选取１０株幼苗，测定株高、茎粗、叶面积、地上部鲜重、根鲜重和根体积等生长指标，测定方法参照高晓旭等［１０］。１．３根际基质细菌多样性分析１．３．１根际基质样品收集与基因组ＤＮＡ提取播种后２８Ｄ，每处理每重复随机选取１５株黄瓜幼苗，根际基质的收集参照聂艳丽等的方法［１１］，抖落根区基质后，用小刷子将根系紧密附着的基质轻轻扫下，收集、混匀，过２ＭＭ筛，去除较大的基质块和植物根系组织，将所得基质装入无菌自封袋中，－８０℃冰箱保存，用于细菌基因组ＤＮＡ提取。使用ＯＭＥＧＡ公司Ｅ．Ｚ．Ｎ．ＡＳＯＩＬＤＮＡ试剂盒抽提基质基因组ＤＮＡ，采用大量ＤＮＡ产物纯化试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）进行纯化。采用１％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组ＤＮＡ，并采用ＮＡＮＯＤＲＯＰ（ＴＨＥＲＭＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，ＵＳＡ）测定ＤＮＡ浓度。１．３．２１６ＳＲＲＮＡＰＣＲ扩增与４５４焦磷酸测序以纯化后的基因组ＤＮＡ为模板，采用细菌通５５中国农业大学学报２０１８年第２３卷用引物对１６ＳＲＲＮＡ的Ｖ３区进行ＰＣＲ扩增，引物序列分别为３４１Ｆ（５′－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３′）和１０７３Ｒ（５′－ＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＲＣＣＡＴＧ－３′），由上海美吉生物医药科技有限公司合成。同时在３４１Ｆ引物的５′－端添加ＢＡＲＣＯＤＥ序列区分样品。反应体系包括ＦＡＳＴＰＦＵ聚合酶（全式金生物技术有限公司，北京）０．４ΜＬ、５ＦＡＳＴＰＦＵ缓冲液４．０ΜＬ、２．５ＭＭＯＬ／ＬＤＮＴＰＳ２ΜＬ、正向引物（５ΜＭＯＬ／Ｌ）０．４ΜＬ、反向引物（５ΜＭＯＬ／Ｌ）０．４ΜＬ、模板ＤＮＡ１０ＮＧ，补ＤＤＨ２Ｏ至２０ΜＬ。反应程序为９５℃预变性２ＭＩＮ，９５℃变性３０Ｓ，５５℃退火３０Ｓ，７２℃延伸３０Ｓ，２５个循环后，７２℃延伸５ＭＩＮ，保持１０℃直到反应完成。反应在ＧＥＮＥＡＭＰ９７００型ＰＣＲ仪（ＡＢＩ，ＵＳＡ）中进行。每个样品３个重复，将同一样品的ＰＣＲ产物混合后用２％琼脂糖凝胶电泳检测，使用ＡＸＹＰＲＥＰＤＮＡ凝胶回收试剂盒（ＡＸＹＧＥＮ，ＵＳＡ）切胶回收ＰＣＲ产物，ＴＲＩＳ－ＨＣＬ洗脱。２％琼脂糖凝胶电泳再次检测、定量。参照电泳初步定量结果，将ＰＣＲ产物用ＱＵＡＮＴＩＦＬＵＯＲＴＭ－ＳＴ蓝色荧光定量系统（ＰＲＯＭＥＧＡ，ＵＳＡ）进行检测定量，将各扩增产物等量（１００ＮＧ）混合，用于４５４测序。测序由上海美吉生物医药科技有限公司使用４５４ＧＳ－ＦＬＸ（４５４ＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥＳ／ＲＯＣＨＥＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ，ＣＴ，ＵＳＡ）完成，试剂采用ＲＯＣＨＥＧＳＦＬＸ＋ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧＭＥＴＨＯＤＭＡＮＵＡＬ＿ＸＬＲ７０ＫＩＴ。测序读长为４００ＢＰ。１．３．３序列数据分析通过ＢＡＲＣＯＤＥ区分各样品的测序数据，并生成不含ＢＡＲＣＯＤＥ的各样品测序的有效序列ＦＡＳＴＡ文件。然后对有效序列进行去杂优化，包括保留引物的错配数在２个以内的序列；使用ＳＥＱＣＬＮ软件（ＨＴＴＰ／／ＳＯＵＲＣＥＦＯＲＧＥ．ＮＥＴ／ＰＲＯＪＥＣＴＳ／ＳＥＱＣＬＥＡＮ／）检测接头和修剪末端，去除序列末端的后引物的接头序列、多碱基Ｎ、ＰＯＬＹＡ／Ｔ尾巴及低质量碱基；使用ＭＯＴＨＵＲ软件（ＨＴＴＰ／／ＷＷＷ．ＭＯＴＨＵＲ．ＯＲＧ／ＷＩＫＩ／ＭＡＩＮ＿ＰＡＧＥ）去除长度短于２００ＢＰ，模糊碱基数＞０、序列平均质量＜２５的序列［１２］。采用ＭＯＴＨＵＲ软件进行ＯＴＵ（可操作分类单元，ＯＰＥＲＡＴＩＯＮＡＬＴＡＸＯＮＯＭＩＣＵＮＩＴＳ）聚类分析，主要步骤包括合并序列长度和碱基组成完全一致的序列，提取非重复序列；采用ＫＭＥＲＳＥＡＲＣＨＩＮＧ的方法（ＨＴＴＰ／／ＷＷＷ．ＭＯＴＨＵＲ．ＯＲＧ／ＷＩＫＩ／ＡＬＩＧＮ．ＳＥＱＳ），与ＳＩＬＶＡ数据库（ＳＳＵ１１１版）中的ＡＬＩＧＮＥＤ核糖体序列数据库（１６Ｓ／１８Ｓ、ＳＳＵ）进行比对［１３］；使用ＵＣＨＩＭＥ（ＨＴＴＰ／／ＤＲＩＶＥ５．ＣＯＭ／ＵＳＥＡＲＣＨ／ＭＡＮＵＡＬ／ＵＣＨＩＭＥ＿ＡＬＧＯ．ＨＴＭＬ）检测并去除ＣＨＩＭＥＲＩＣ序列［１４］；计算比对对齐后的序列间非校正配对距离，使用ＦＵＲＴＨＥＳＴＮＥＩＧＨＢＯＲ方法（ＨＴＴＰ／／ＷＷＷ．ＭＯＴＨＵＲ．ＯＲＧ／ＷＩＫＩ／ＣＬＵＳＴＥＲ）按相似度９７％聚类生成ＯＴＵ。使用稀释曲线（ＲＡＲＥＦＡＣＴＩＯＮＣＵＲＶＥ）和ＳＨＡＮＮＯＮ－ＷＩＥＮＥＲ曲线表征样品的测序深度［１５］，采用ＭＯＴＨＵＲ程序得出ＡＣＥ指数和ＣＨＡＯ１指数表示物种的丰富度，以ＳＨＡＮＮＯＮ指数和ＳＩＭＰＳＯＮ指数评估样品的物种多样性［１６］。为了获得每个ＯＴＵ的分类学信息，将９７％相似水平下每个ＯＴＵ中的所有序列进行一致性分析，找出同一个ＯＴＵ中的不同序列的最近祖先的种属信息作为该ＯＴＵ的种属信息。所用软件为ＭＯＴＨＵＲ分类学分析（ＨＴＴＰ／／ＷＷＷ．ＭＯＴＨＵＲ．ＯＲＧ／ＷＩＫＩ／ＣＬＡＳＳＩＦＹ．ＳＥＱＳ），算法为ＮＡＶＥＢＡＹＥＳＩＡＮＣＬＡＳＳＩＦＩＥＲ［１７］。１．４数据统计分析试验结果用３次重复的平均值标准差（ＭＥＡＮＳＤ）表示，采用ＳＴＵＤＥＮＴ＇ＳＴ－检验进行差异显著性分析。２结果与分析２．１壳聚糖对黄瓜穴盘苗生长发育的影响基质添加壳聚糖对黄瓜幼苗出苗率及出苗速率没有显著影响。但播种后２８Ｄ时幼苗株高、地上部鲜重以及第二真叶面积等参数显著高于对照（表１），可见，基质添加壳聚糖可以促进黄瓜穴盘苗的生长。２．２４５４焦磷酸测序数据的统计分析采用４５４焦磷酸测序法分析不同基质样品的细菌多样性，如表２所示，共获得９８５９６条有效序列，序列平均长度为４１３ＢＰ，按照质量控制原则对有效序列进行筛选，筛选后的优化序列共７１７８０条，优化序列平均长度为４６９ＢＰ，每个样品得到的优化序列数量为１１８０７～１２１５１条。经比对，共有６６０６８条序列可以比对到ＳＩＬＶＡ数据库中，占优质序列的９２．０４％。在９７％相似度水平，共获得１２６５０个ＯＴＵ，对照样品中ＯＴＵ数量分别为２２８０、２１７９和２２８５条，添加壳聚糖的基质中ＯＴＵ数量略低，分别为１９１４、２０１７和１９７５条。６５第１期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响表１壳聚糖对黄瓜穴盘苗生长发育的影响ＴＡＢＬＥ１ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＴＨＥＧＲＯＷＴＨＡＮＤＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳ样品ＳＡＭＰＬＥ株高／ＣＭＳＨＯＯＴＨＥＩＧＨＴ茎粗／ＭＭＳＴＥＭＤＩＡＭＥＴＥＲ地上部鲜重／ＧＳＨＯＯＴＦＲＥＳＨＷＥＩＧＨＴ第一真叶面积／ＣＭ２１ＳＴＬＥＡＦＡＲＥＡ第二真叶面积／ＣＭ２２ＮＤＬＥＡＦＡＲＥＡ根鲜重／ＧＲＯＯＴＦＲＥＳＨＷＥＩＧＨＴ根体积／ＭＬＲＯＯＴＶＯＬＵＭＥＣＫ１１．８５０．４０３．３３０．０７２．７４０．０９３０．２８２．１８１４．７５１．８９１．１４０．１４１．１４０．１５壳聚糖ＣＴＳ１２．４６０．２４＊３．４８０．２０２．９７０．１２＊３１．２１２．６６２１．２４１．１１＊＊１．０８０．０４１．１４０．０５注＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，表示在０．０５和０．０１水平与对照相比差异显著。下同。ＮＯＴＥ＊Ｐ＜０．０５ＡＮＤ＊＊Ｐ＜０．０１ＩＮＤＩＣＡＴＩＮＧＴＨＥＳＩＧＮＩＦＩＣＡＮＴＤＩＦＦＥＲＥＮＣＥＣＯＭＰＡＲＥＤＴＯＴＨＥＣＯＲＲＥＳＰＯＮＤＩＮＧＶＡＬＵＥＩＮＴＨＥＣＯＮＴＲＯＬ．ＴＨＥＳＡＭＥＢＥＬＯＷ．表２黄瓜穴盘苗各根际基质样品４５４测序数据量统计ＴＡＢＬＥ２ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳＯＦ４５４ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧＤＡＴＡＦＯＲＤＩＦＦＥＲＥＮＴＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＩＣＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳＡＭＰＬＥＳＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳ样品ＳＡＭＰＬＥ有效序列ＶＡＬＩＤＳＥＱＵＥＮＣＥＳ优化序列ＡＴＲＩＭＥＤＳＥＱＵＥＮＣＥＳ匹配的序列ＢＭＡＴＣＨＥＤＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＴＵ数量ＣＮＵＭＢＥＲＯＦＯＴＵＳＲ１１６４０１１２００６（７３．２０％）１０８９８（９０．７７％）２２８０ＣＫＲ２１６１３６１１８１５（７３．２２％）１０８５９（９１．９１％）２１７９Ｒ３１６６５７１２１５１（７２．９５％）１１１９９（９２．１７％）２２８５Ｒ１１６２５９１１８０７（７２．６２％）１０９８１（９３．００％）１９１４壳聚糖ＣＴＳＲ２１６７９５１２０２２（７１．５９％）１１０７６（９２．１３％）２０１７Ｒ３１６３４８１１９７９（７３．２８％）１１０５５（９２．２９％）１９７５总计９８５９６７１７８０６６０６８１２６５０注Ａ括号内数字表示优化序列占有效序列的百分比；Ｂ括号内数字表示匹配的序列占优化序列的百分比；ＣＯＴＵ聚类的相似度水平为９７％。ＮＯＴＥＡＴＨＥＮＵＭＢＥＲＳＩＮＴＨＥＢＲＡＣＫＥＴＳＩＮＤＩＣＡＴＥＴＨＥＰＥＲＣＥＮＴＡＧＥＳＯＦＴＲＩＭＥＤＳＥＱＵＥＮＣＥＩＮＴＨＥＣＯＲＲＥＳＰＯＮＤＩＮＧＶＡＬＩＤＳＥＱＵＥＮＣＥ；ＢＴＨＥＮＵＭＢＥＲＳＩＮＴＨＥＢＲＡＣＫＥＴＳＩＮＤＩＣＡＴＥＴＨＥＰＥＲＣＥＮＴＡＧＥＳＯＦＭＡＴＣＨＥＤＳＥＱＵＥＮＣＥＩＮＴＨＥＣＯＲＲＥＳＰＯＮＤＩＮＧＴＲＩＭＥＤＳＥＱＵＥＮＣＥ；ＣＯＴＵＳＷＥＲＥＣＬＡＳＳＩＦＩＥＤＡＴ９７％ＳＩＭＩＬＡＲＩＴＹ．稀释曲线可以反映样品的测序深度，如图１所示，在９７％的相似度水平下，不同根际基质样品的稀释曲线趋于平坦，但均未达到饱和，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的ＯＴＵ，该测序深度能基本完整反映细菌群落多样性。ＳＨＡＮＮＯＮ－ＷＩＥＮＥＲ曲线利用各样品的测序量在不同测序深度时的ＳＨＡＮＮＯＮ指数构建曲线，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。由图１可知，所有样品的ＳＨＡＮＮＯＮ指数均达到平台期，进一步说明所有样品的测序深度均能反映根际细菌多样性信息。２．３添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响将各样品测序获得的优质序列用于评价基质细菌多样性，如表３所示。ＡＣＥ和ＣＨＡＯ１指数用于估图１不同根际基质样品的稀释曲线和ＳＨＡＮＮＯＮ－ＷＩＥＮＥＲ曲线（相似水平９７％）ＦＩＧ．１ＲＡＲＥＦＡＣＴＩＯＮＡＮＤＳＨＡＮＮＯＮ－ＷＩＥＮＥＲＣＵＲＶＥＳＯＦＤＩＦＦＥＲＥＮＴＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＩＣＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳＡＭＰＬＥＳ（ＡＴ９７％ＳＩＭＩＬＡＲＩＴＹ）７５中国农业大学学报２０１８年第２３卷计样品中物种总数，可以反映样品的物种丰富度。添加壳聚糖的基质中ＡＣＥ和ＣＨＡＯ１指数显著降低（Ｐ＜０．０１），表明基质添加壳聚糖可以降低黄瓜根际基质中细菌的丰富度。ＳＩＭＰＳＯＮ和ＳＨＡＮＮＯＮ指数反映样品中微生物多样性。ＳＨＡＮＮＯＮ值越大，表明群落多样性越高；与之相反，ＳＩＭＰＳＯＮ指数值越小，表明群落多样性越高。如表３所示，添加壳聚糖后，ＳＨＡＮＮＯＮ指数减小，ＳＩＭＰＳＯＮ指数增大，表明根际细菌群落多样性水平降低。可见，基质添加壳聚糖可以引起黄瓜穴盘苗根际细菌群落丰富度和多样性水平降低。表３壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质样品的细菌多样性的影响ＴＡＢＬＥ３ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＴＨＥＡＬＰＨＡ－ＤＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＯＭＭＵＮＩＴＩＥＳＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳ样品ＳＡＭＰＬＥ丰富度指数ＲＩＣＨＮＥＳＳＩＮＤＥＸ多样性指数ＤＩＶＥＲＳＩＴＹＩＮＤＥＸＡＣＥＣＨＡＯ１ＳＨＡＮＮＯＮＳＩＭＰＳＯＮ对照ＣＫ５９３１２８５４３７２３３３６．４６９０．０３４０．００６１５０．０００４１５壳聚糖ＣＴＳ４６４４２３９＊＊３４１２２６２＊６．０８４０．０３７＊＊０．０１１９３０．０００８２４＊＊２．４基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响利用ＯＴＵ序列信息对黄瓜穴盘苗的根际细菌群落组成进行分析。在科分类水平，在对照和添加壳聚糖的根际基质样品中，分别鉴定到１３８和１２９个科，２种样品中共有的科有１１０个。其中相对丰度大于０．５％的已知细菌科有３０个，如图２所示。对照样品主要的细菌有丛毛单胞菌科（ＣＯＭＡＭＯＮＡＤＡＣＥＡＥ，８．７１％）、黄单胞菌科（ＸＡＮＴＨＯ－ＭＯＮＡＤＡＣＥＡＥ，５．８６％）、假单胞菌科（ＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡ－ＤＡＣＥＡＥ，５．７４％）、柄杆菌科（ＣＡＵＬＯＢＡＣＴＥＲＡＣＥＡＥ，３．８６％）、草酸杆菌科（ＯＸＡＬＯＢＡＣＴＥＲＡＣＥＡＥ，３．８４％）和红螺菌科（ＲＨＯＤＯＳＰＩＲＩＬＡＣＥＡＥ，３．０６％）。添加壳聚糖后，根际基质中主要细菌为丛毛单胞菌科（１１．５８％）、假单胞菌科（８．２０％）、黄单胞菌科（４．０５％）、柄杆菌科（３．５３％）、微杆菌科（ＭＩＣＲＯＢＡＣＴＥＲＩＡＣＥＡＥ，３．４３％）、红螺菌科（３．３８％）和根瘤菌科（ＲＨＩＺＯＢＩＡＣＥＡＥ，３．２１％）。其中丛毛单胞菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘脂单胞菌科、鞘脂杆菌科（ＳＰＨＩＮＧＯＢＡＣＴＥＲＩＡＣＥＡＥ）、微单胞菌科（ＭＩＣＲＯＭＯＮＯＳＰＯＲＡＣＥＡＥ）等的相对丰度显著升高，而黄单胞菌科、草酸杆菌科、酸杆菌科（ＡＣＩＤＯＢＡＣＴＥＲＩＡＣＥＡＥ）、丰祐菌科（ＯＰＩＴＵＴＡＣＥＡＥ）等的相对丰度显著降低（图２）。在属分类水平，所有ＯＴＵ序列共分为３４０个属，其中对照根际基质样品中共鉴定到２９９个属，添加壳聚糖的基质中较低，只有２７６个属。相对丰度大于０．３％的已知细菌属共４１个，如图３所示。对照根际基质样品中，ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属（５．８３％）、纤维弧括号内数字表示相对丰度，为３次重复的平均值。ＴＨＥＮＵＭＢＥＲＳＩＮＴＨＥＢＲＡＣＫＥＴＳＡＲＥＴＨＥＲＥＬＡＴＩＶＥＡＢＵＮＤＡＮＣＥＳＯＦＥＡＣＨＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＬＡＳＳ．ＤＡＴＡＲＥＰＲＥＳＥＮＴＴＨＥＭＥＡＮＳＯＦＴＨＲＥＥＲＥＰＬＩＣＡＴＥＳ．图２壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质细菌群落的影响（科分类水平）ＦＩＧ．２ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＯＭＭＵＮＩＴＹＳＴＲＵＣＴＵＲＥＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳＡＴＦＡＭＩＬＹＬＥＶＥＬ８５第１期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响图３壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质细菌群落的影响（属分类水平）ＦＩＧ．３ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＢＡＣＴＥＲＩＡＬＣＯＭＭＵＮＩＴＹＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳＡＴＧＥＮＵＳＬＥＶＥＬ菌属ＣＥＬＬＶＩＢＲＩＯ（５．３５％）、ＤＯＫＤＯＮＥＬＬＡ属（４．２５％）和ＭＡＳＳＩＬＩＡ属（３．２６％）为优势菌属，其相对丰度均大于３％。添加壳聚糖后，ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属、纤维弧菌属的相对丰度显著升高，而ＤＯＫＤＯＮＥＬＬＡ属和ＭＡＳＳＩＬＩＡ属的相对丰度则显著降低。此外，ＤＯＮＧＩＡ属、根瘤菌属ＲＨＩＺＯＢＩＵＭ、鞘氨醇单胞菌属ＳＰＨＩＮＧＯＭＯＮＡＳ、微杆菌属ＭＩＣＲＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ、ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ属、ＦＬＡＶＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ属和ＰＲＯＳＴＨＥＣＯＢＡＣＴＥＲ属的相对含量均有显著升高；而相对丰度显著降低的细菌菌群有ＨＡＬＩＡＮＧＩＵＭ属、食酸菌属ＡＣＩＤＯＶＯＲＡＸ、丰祐菌属ＯＰＩＴＵＴＵＳ、纤维单胞菌属ＣＥＬＬＵＬＯＭＯＮＡＳ等（图３）。进一步将得到的ＯＴＵ鉴定到种，但是多数序列无法获得其菌种信息，图４列出了７种发生显著差异的已知细菌的相对丰度变化。如图４所示，根瘤菌属Ｒ．ＴＲＯＰＩＣＩ和Ｒ．ＥＴＬＩ的相对丰度分别是对照样品的１．６０和１．３８倍；此外，ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属Β－ＰＲＯＴＥＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ１４３、微杆菌属Ｍ．ＰＡＲＡＯＸＹＤＡＮＳ、指孢囊菌属Ｄ．ＡＵＲＡＮＴＩＡＣＵＭ和中慢生根瘤菌属ＭＥＳＯＲＨＩＺＯＢＩＵＭＣＩＣＥＲＩ的相对丰度也有显著升高。相比对照，添加壳聚糖的根际基质中ＭＡＳＳＩＬＩＡ属Ｍ．ＴＥＬＬＵＲＩＡＭＩＸＴＡ的相对丰度显著降低，只有对照的６３．４７％。３结论与讨论基质添加壳聚糖可以显著促进黄瓜穴盘苗的生长发育（表１），进一步采用４５４焦磷酸测序技术分析了基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，发现添加壳聚糖后根际基质的ＡＣＥ和ＣＨＡＯ１指数显著降低，ＳＨＡＮＮＯＮ指数减小，ＳＩＭＰＳＯＮ指数增大（表３），表明壳聚糖可以引起根际基质细菌丰富度和群落多样性显著降低。分析原因，壳聚糖可以作为一种新的碳源物质，被根际某些细菌分解利用，因此为根际细菌的生长提供了一个选择性的环境，利于可以分解和利用壳聚糖的细菌生长，而原有细菌菌群受到竞争性抑制，从而导致根际细菌多样性降低［１８－１９］。基质添加壳聚糖可以改变黄瓜穴盘苗的根际细菌群落组成。基质添加壳聚糖后，穴盘苗根际基质中ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属、纤维弧菌属、根瘤菌属、ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ属、ＦＬＡＶＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ属等的相对丰度显著升高，而原有优势菌属ＤＯＫＤＯＮＥＬＬＡ属、ＭＡＳＳＩＬＩＡ属、食酸菌属、丰祐菌属、纤维单胞菌属等的相对丰度则显著降低（图２和图３），这与已报道的土壤中添加壳聚糖后植物根际细菌群落的变化趋势相一致［１８，２０－２１］。进一步分析这些上调菌群的生物学功能，发现９５中国农业大学学报２０１８年第２３卷图４壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际基质中７种细菌相对丰度的影响ＦＩＧ．４ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＯＮＴＨＥＲＥＬＡＴＩＶＥＡＢＵＮＤＡＮＣＥＯＦＳＥＶＥＮＢＡＣＴＥＲＩＡＬＳＰＥＣＩＥＳＩＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＰＬＵＧＳＥＥＤＬＩＮＧＳＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属、纤维弧菌属、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ属等细菌多为植物促生菌。多数ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属细菌基因组中含有糖苷水解酶编码基因，可以分解基质中的纤维素、半纤维素以及外源添加的壳聚糖等多糖分子，为幼苗生长提供更多的碳源和养分，促进幼苗生长［１９，２２］。添加壳聚糖后纤维弧菌属的丰度显著增加，这与之前的报道一致。ＳＡＴＯ等发现在河流、壕沟等不同的生态环境中添加甲壳素或壳聚糖后，纤维弧菌属细菌均显著增多成为优势菌群［１８］。多数纤维弧菌属细菌可以合成几丁质酶，分解壳聚糖［１８，２３］，甚至一些纤维弧菌，如Ｃ．ＪＡＰＯＮＩＣＵＳ经甲壳素诱导后会分泌多种多糖水解酶，促进根际糖类物质的分解和活化［２４］。此外，部分纤维弧菌属细菌还具有固氮功能，对植物根部氮素的吸收具有促进作用［２５－２６］。另一类显著升高的根际细菌为根瘤菌属。黄瓜穴盘苗根际主要的根瘤菌包括Ｒ．ＥＴＬＩ和Ｒ．ＴＲＯＰＩＣＩ（图４），这两种细菌广泛存在于植物根际土壤中，是最主要的植物非共生固氮菌［２７］。纤维弧菌和根瘤菌数量的升高有助于植物根部氮的固定和利用，促进植物生长。鞘氨醇单胞菌属和ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ属细菌的增多有助于植物抵御根部细菌或真菌性病害［２８－２９］。ＶＡＮＢＲＵＧＧＥＮ等［２８］发现，根际鞘氨醇单胞菌可以提高莴苣抗根腐病的能力。此外，壳聚糖自身对嗜酸菌属、黄单胞菌属等植物致病性细菌也具有一定的抑菌效果［２，３０］。可见，基质添加壳聚糖后，引起黄瓜穴盘苗根际ＰＥＬＯＭＯＮＡＳ属、纤维弧菌属、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、ＰＥＤＯＢＡＣＴＥＲ属等具有促生潜力的细菌数量增多，促进植物根部碳、氮等养分的活化和吸收，抵御根际致病性细菌的繁殖和侵染，从而改善黄瓜穴盘苗的根际微生态环境，促进幼苗的生长发育。本研究采用４５４焦磷酸测序技术分析了基质添加壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌群落结构的影响，丰富了壳聚糖的促生机制。相较于传统分离培养的方法，基于ＰＣＲ的测序技术在分析量和信息量上具有明显的优势，但这种方法也有一定的局限性，无法将游离于细胞外的ＤＮＡ以及死亡细胞的ＤＮＡ与具有活性的细胞ＤＮＡ区分开来，且序列信息的解析基于数据库，部分序列无法获得其分类信息［３１］。因此，对黄瓜穴盘苗根际促生细菌的分离和功能鉴定，并探究其促进幼苗生长的作用机制，将是下一步开展的工作重点。参考文献ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ［１］ＺＯＵＰ，ＹＡＮＧＸ，ＷＡＮＧＪ，ＬＩＹ，ＹＵＨ，ＺＨＡＮＧＹ，ＬＩＵＧ．ＡＤＶＡＮＣＥＳＩＮＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＡＴＩＯＮＡＮＤＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳＯＦＣＨＩＴＯＳＡＮＡＮＤＣＨＩＴＯＳＡＮＯＬＩＧＯＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ［Ｊ］．ＦＯＯＤＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２０１６，１９０１１７４－１１８１［２］ＭＡＬＥＲＢＡＭ，ＣＥＲＡＮＡＲ．ＣＨＩＴＯＳＡＮＥＦＦＥＣＴＳＯＮＰＬＡＮＴＳＹＳＴＥＭＳ［Ｊ］．ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＪＯＵＲＮＡＬＯＦＭＯＬＥＣＵＬＡＲＳＣＩＥＮＣＥＳ，２０１６，１７９９６［３］ＫＨＡＮＷＭ，ＰＲＩＴＨＩＶＩＲＡＪＢ，ＳＭＩＴＨＤＬ．ＥＦＦＥＣＴＯＦＦＯＬＩＡＲＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＯＦＣＨＩＴＩＮＡＮＤＣＨＩＴＯＳＡＮＯＬＩＧＯＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳＯＮＰＨＯＴＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳＯＦＭＡＩＺＥＡＮＤＳＯＹＢＥＡＮ［Ｊ］．ＰＨＯＴＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣＡ，２００２，４０６２１－６２４［４］于仁竹，于贤昌，王桂红．壳聚糖对黄瓜幼苗生长和生理特性的影响［Ｊ］．西北农业学报，２００３，１２（４）１０２－１０４ＹＵＲＺ，ＹＵＸＣ，ＷＡＮＧＧＨ．ＥＦＦＥＣＴＯＦＣＨＩＴＩＮＯＮＴＨＥＧＲＯＷＴＨＡＮＤＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＳＥＥＤＬＩＮＧ［Ｊ］．ＡＣＴＡＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＥＢＯＲＥＡＬＩ－ＯＣＣＩＤＥＮＴＡＬＩＳＳＩＮＩＣＡ，２００３，１２（４）１０２－１０４（ＩＮＣＨＩＮＥＳＥ）［５］ＡＨＭＡＤＩＢ，ＳＨＡＲＩＡＴＰＡＮＡＨＩＭＥ．ＰＲＯＬＩＮＥＡＮＤＣＨＩＴＯＳＡＮＥＮＨＡＮＣＥＤ０６第１期董春娟等壳聚糖对黄瓜穴盘苗根际细菌多样性的影响ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹＯＦＭＩＣＲＯＳＰＯＲＥＥＭＢＲＹＯＧＥＮＥＳＩＳＩＮＤＵＣＴＩＯＮＡＮＤＰＬＡＮＴＬＥＴＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮＩＮＢＲＡＳＳＩＣＡＮＡＰＵＳＬ［Ｊ］．ＰＬＡＮＴＣＥＬＬ，ＴＩＳＳＵＥＡＮＤＯＲＧＡＮＣＵＬＴＵＲＥ，２０１５，１２３５７－６５［６］蒋小姝，莫海涛，苏海佳，张小勇．甲壳素及壳聚糖在农业领域方面的应用［Ｊ］．中国农学通报，２０１３，２９（６）１７０－１７４ＪＩＡＮＧＸＺ，ＭＯＨＴ，ＳＵＨＪ，ＺＨＡＮＧＸＹ．ＴＨＥＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＯＦＣＨＩＴＩＮＡＮＤＣＨＩＴＯＳＡＮＩＮＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ［Ｊ］．ＣＨＩＮＥＳＥＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＳＣＩＥＮＣＥＢＵＬＬＥＴＩＮ，２０１３，２９（６）１７０－１７４（ＩＮＣＨＩＮＥＳＥ）［７］ＶＥＮＴＵＲＩＶ，ＫＥＥＬＣ．ＳＩＧＮＡＬＩＮＧＩＮＴＨＥＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＥ［Ｊ］．ＴＲＥＮＤＳＩＮＰＬＡＮＴＳＣＩＥＮＣＥ，２０１６，２１（３）１８７－１９８［８］康贻军，程洁，梅丽娟，胡健，朴哲，殷士学．植物根际促生菌作用机制研究进展［Ｊ］．应用生态学报，２０１０，２１（１）２３２－２３８ＫＡＮＧＹＪ，ＣＨＥＮＧＪ，ＭＥＩＬＪ，ＨＵＪ，ＰＩＡＯＺ，ＹＩＮＳＸ．ＡＣＴＩＯＮＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳＯＦＰＬＡＮＴＧＲＯＷＴＨ－ＰＲＯＭＯＴＩＮＧＲＨＩＺＯＢＡＣＴＥＲＩＡ（ＰＧＰＲ）ＡＲＥＶＩＥＷ［Ｊ］．ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＰＰＬＩＥＤＥＣＯＬＯＧＹ，２０１０，２１（１）２３２－２３８（ＩＮＣＨＩＮＥＳＥ）［９］ＳＥＲＫＥＢＡＥＶＡＹＭ，ＫＩＭＹ，ＬＩＥＳＡＣＫＷ，ＤＥＤＹＳＨＳＮ．ＰＹＲＯＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ－ＢＡＳＥＤＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴＯＦＴＨＥＢＡＣＴＥＲＩＡＤＩＶＥＲＳＩＴＹＩＮＳＵＲＦＡＣＥＡＮＤＳＵＢＳＵＲＦＡＣＥＰＥＡＴＬＡＹＥＲＳＯＦＡＮＯＲＴＨＥＲＮＷＥＴＬＡＮＤ，ＷＩＴＨＦＯＣＵＳＯＮＰＯＯＲＬＹＳＴＵＤＩＥＤＰＨＹＬＡＡＮＤＣＡＮＤＩＤＡＴＥＤＩＶＩＳＩＯＮＳ［Ｊ］．ＰＬＯＳＯＮＥ，２０１３，８（５）Ｅ６３９９４［１０］高晓旭，张志刚，段颖，董春娟，尚庆茂．高浓度营养液对黄瓜和番茄下胚轴徒长的抑制作用．植物营养与肥料学报［Ｊ］，２０１４，２０（５）１２３４－１２４２ＧＡＯＸＸ，ＺＨＡＮＧＺＧ，ＤＵＡＮＹ，ＤＯＮＧＣＪ，ＳＨＡＮＧＱＭ．ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮＥＦＦＥＣＴＯＦＨＩＧＨＳＴＲＥＮＧＴＨＮＵＴＲＩＥＮＴＳＯＬＵＴＩＯＮＯＮＨＹＰＯＣＯＴＹＬＳＴＲＥＴＣＨＯＦＣＵＣＵＭＢＥＲＡＮＤＴＯＭＡＴＯＳＥＥＤＬＩＮＧＳ［Ｊ］．ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＬＡＮＴＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＮＤＦＥＲＴＩＬＩＺＥＲ，２０１４，２０（５）１２３４－１２４２（ＩＮＣＨＩＮＥＳＥ）［１１］聂艳丽，陆斌，刘金凤，童清．不同育苗基质的团花根际微生物群落功能多样性特征［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２０１４，３４（１）７－１１ＮＩＥＹＬ，ＬＵＢ，ＬＩＵＪＦ，ＴＯＮＧＱ．ＤＩＶＥＲＳＩＴＹＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳＯＦＲＨＩＺＯＳＰＨＥＲＩＣＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＭＩＳＭＣＯＭＭＵＮＩＴＹＦＵＮＣＴＩＯＮＯＦＡＮＴＨＯＣＥＰＨＡＬＵＳＣＨＩＮＥＮＳＩＳＣＵＬＴＵＲＥＤＷＩＴＨＤＩＦＦＥＲＥＮＴＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ［Ｊ］．ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＥＮＴＲＡＬＳＯＵＴＨＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＦＯＲＥＳＴＲＹ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，２０１４，３４（１）７－１１（ＩＮＣＨＩＮＥＳＥ）［１２］ＳＣＨＬＯＳＳＰＤ，ＷＥＳＴＣＯＴＴＳＬ，ＲＹＡＢＩＮＴ，ＨＡＬＪＲ，ＨＡＲＴＭＡＮＮＭ，ＨＯＬＩＳＴＥＲＥＢ，ＬＥＳＮＩＥＷＳＫＩＲＡ，ＯＡＫＬＥＹＢＢ，ＰＡＲＫＳＤＨ，ＲＯＢＩＮＳＯＮＣＪ，ＳＡＨＬＪＷ，ＳＴＲＥＳＢ，ＴＨＡＬＩＮＧＥＲＧＧ，ＶＡＮＨＯＲＮＤＪ，ＷＥＢＥＲＣＦ．ＩＮＴＲＯＤＵＣＩＮＧＭＯＴＨＵＲＯＰＥＮＳＯＵＲＣＥ，ＰＬＡＴＦＯＲＭ－ＩＮＤＥＰＥＮＤＥＮＴ，ＣＯＭＭＵＮＩＴＹ－ＳＵＰＰＯＲＴＥＤＳＯＦＴＷＡＲＥＦＯＲＤＥＳＣＲＩＢＩＮＧＡＮＤＣＯＭＰＡＲＩＮＧＭＩＣＲＯＢＩＡＬＣＯＭＭＵＮＩＴＩＥＳ［Ｊ］．ＡＰＰＬＩＥＤ＆ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００９，７５（２３）７５３７－７５４１［１３］ＰＲＵＥＳＳＥＥ，ＱＵＡＳＴＣ，ＫＮＩＴＴＥＬＫ，ＦＵＣＨＳＢＭ，ＬＵＤＷＩＧＷ，ＰＥＰＬＩＥＳＪ，Ｇ/p