大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法的建立.pdf

doi 10 19928 ki 1000 6346 2021 0014 大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法的建立 任峻辉 刘 焱 吉晶晶 陈志强 张耀伟 东北农业大学园艺园林学院 黑龙江哈尔滨 150030 摘 要 近年来华北和东北地区大白菜细菌性角斑病的危害逐年加重 抗角斑病已成为大白菜育种的重要研究方向 但目前 尚未建立完善的大白菜抗细菌性角斑病鉴定方法 本试验对哈尔滨市向阳乡东北农业大学实验实习基地大白菜细菌性角斑病 病原菌进行分离鉴定 确定病原菌为丁香假单孢菌丁香致病型 Pseudomonas syringae pv syringae van Hall 以该分离物为 接种病原 以大白菜自交系 A224 1为试验材料 采用 L 9 3 4 正交试验设计 分析接种温度 湿度 苗龄对细菌性角斑病 发病的影响 并以自交系 264 1 1 203 1及 331 1为试验材料 筛选适宜的接种浓度 结果表明 苗龄 7 8叶期 接种温 度 25 30 接种湿度 90 100 为大白菜细菌性角斑病发病的最佳条件组合 最佳接种浓度为 1 10 10 cfu mL 1 关键词 大白菜 细菌性角斑病 抗病性鉴定 苗期细菌性角斑病发病的影响 以期建立大白菜细 菌性角斑病的抗性鉴定方法 为大白菜抗细菌性角 斑病种质资源筛选以及抗病育种奠定基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 大白菜细菌性角斑病病样于 2018 年 8 月采自 哈尔滨市向阳乡东北农业大学实验实习基地大白菜 育种谱地 供试大白菜为东北农业大学园艺学院 选育的自交系 A224 1 感病 264 1 1 感病 203 1 耐病 及 331 1 抗病 1 2 试验方法 1 2 1 细菌性角斑病病原菌分离 取发病株叶片 用清水冲洗干净 在无菌环境下切取病健交界处 5 mm 5 mm 的小块 浸入 70 乙醇中消毒 3 4 s 再用无菌水反复清洗 4 5次 每次清洗 3 min 然 后用灭菌玻璃棒将表面消毒后的病叶组织研碎 并 加入少量无菌水稀释 用涂布棒蘸取菌液均匀涂在 KB 固体培养基上 放入 28 恒温培养箱内进行培 养 待单菌落出现 挑取单菌落于 KB 液体培养基 中扩繁菌株 备用 张吉光 等 2010 1 2 2 病原菌分子鉴定 采用 16S rDNA 通用引物 1492R 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCA 3 27F 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 gyrB 基因 引物 UP 1E 5 TGTAAAACGACGGCCAGTGCNG 大白菜细菌性角斑病是猝发性病害 对大白菜 的产量及品质影响较大 近年来该病害不仅发生得 愈加频繁而且发病地域越来越广泛 华北 东北地 区发生普遍 山东 河南 四川等地也均有发生 抗细菌性角斑病已成为大白菜育种的重要方向 抗 病育种需要有抗病种质资源 简单有效的接种鉴定 方法是鉴定资源抗病性的前提 也是抗病育种的基 础 大白菜细菌性角斑病发现近 60 年 发病呈上 升趋势 但至今还未见关于大白菜抗细菌性角斑 病鉴定方法的报道 细菌性角斑病的病原菌为丁香 假单孢菌 Pseudomonas syringae 能侵染多种蔬 菜作物 Bull et al 2004 2015 Harighi 2007 Takikawa Takahashi 2014 Nay et al 2019 生产中黄瓜细菌性角斑病发病相对较重 较早地建 立了黄瓜细菌性角斑病的抗性鉴定方法 关钟燕 1990 马柏壮 等 2013 本试验研究了不同接种 温度 接种湿度 接种苗龄以及接种浓度对大白菜 任峻辉 女 硕士研究生 主要从事蔬菜遗传育种研究 E mail 525587774 通信作者 Corresponding author 张耀伟 男 研究员 博士生导 师 主要从事蔬菜遗传育种的教学与科研工作 E mail zhyw1271 收稿日期 2020 01 23 接受日期 2020 04 17 基金项目 十三五 国家重点研发计划子课题 2017YFD0101801 6 黑龙江省 百千万 工程科技重大专项 2019ZX16B02 黑龙江省 蔬菜产业技术协同创新体系项目 HNWSCTX2019 64 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 2021 4 64 68 GRTCYTTYTCYTGRCA 3 APrU 5 CAGGAAA CAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA 3 和 rpoD 基因引物 70R 5 ACGACTGACCCGGT ACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT 3 70F 5 ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYA TGMGNGARATGGGNACNGT 3 对菌株进行 PCR 扩增 Yamamoto et al 2000 扩增产物经 1 琼 脂糖凝胶电泳检测 对单一 清晰的亮带进行胶回 收 将胶回收产物与 Buffer 按 4 V 1 V混合 按上 述步骤再进行凝胶电泳 回收产物送华大基因科技 股份有限公司进行测序 测序结果与 NCBI 进行比 对 鉴定 1 2 3 大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法 采用 三因素三水平正交试验设计 按 L 9 3 4 正交表 表 1 设置 9个处理 表 2 分析接种苗龄 湿 度及温度对大白菜细菌性角斑病发病的影响 以喷 接无菌 KB 液体培养基作为对照 每处理 20 株 3 次重复 表 1 L 9 3 4 正交试验因素水平表 水平 因素 A 接种苗龄 B 接种湿度 C 接种温度 1 3 4叶期 50 60 15 20 2 5 6叶期 70 80 20 25 3 7 8叶期 90 100 25 30 将大白菜自交系 A224 1分 3期播种于 7 cm 7 cm 的营养钵中 每期间隔 5 d 每钵播 3粒 拉 十字期留 1株 置于日光温室内 昼 夜温度控制 在 25 28 15 18 待幼苗分别长至 3 4叶 期 5 6 叶期 7 8 叶期进行接种试验 为达到 最佳接种条件 接种试验在人工气候室中进行 病 原菌菌株用 KB 液体培养基扩繁 采用分光光度计 法测定细菌悬浮液浓度并稀释到 1 10 8 cfu mL 1 采取喷接方式 每株选 1片幼叶进行接种并做好标 记 每株接种量 1 5 2 0 mL 接种后保湿 48 h 于接种 7 d 后调查发病情况 得到最佳接种苗龄 接种湿度及接种温度后 将供试菌株配制成 3 个不同浓度菌液 1 10 8 1 10 10 1 10 12 cfu mL 1 分别接种于不同抗性 的 3个大白菜自交系 264 1 1 331 1和 203 1上 保湿 24 h 分别于接种后 7 10 d 调查发病情况 从而确定最佳接种浓度 各级病株数 发病级代表值 调查总株数 最高级发病代表值 病情指数 100 图 1 大白菜细菌性角斑病田间症状 彩色图版见 中国蔬菜 网站 veg org 1 2 4 病情分级与发病情况调查 采用 Image J 软 件测量发病的叶片面积和病斑面积 以病斑面积与 叶片面积的比率划分病情等级 0 级 不发病 1 级 病斑面积 20 3 级 20 病斑面积 40 5 级 40 病斑面积 60 7 级 60 病斑面积 80 9级 病斑面积 80 群体分级标准参照 九五 国家攻关组制定 的病毒病和霜霉病的群体分级标准 免疫 I 病 情指数为 0 高抗 HR 0 病情指数 11 11 抗病 R 11 11 病情指数 33 33 耐病 T 33 33 病情指数 55 55 感病 S 55 55 病 情指数 77 77 高感 HS 77 77 病情指数 100 00 发病率 发病株数 总株数 100 1 3 数据处理 将病情指数进行平方根转换后 采用 DPS 9 50 数据处理系统进行方差分析和差异多重比较分析 2 结果与分析 2 1 大白菜细菌性角斑病病原菌分离 鉴定 取田间发病株 图 1 进行病原菌分离 纯 化 获得 ALP 1 菌株 该菌株在 KB 固体培养基 的表面上菌落显现为乳白色 扁平 近圆形或略呈 不规则形 单菌落的直径为 5 7 mm 中央凸起 且具同心环纹 边缘呈透明状 菌体短杆状 极生 鞭毛 病原菌经 16S rDNA gyrB 和 rpoD 基因扩 增 测序 与 NCBI 网站比对后鉴定为丁香假单孢 菌 Pseudomonas syringae pv syringae van Hall 按照 65 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 柯赫氏法则 将 ALP 1 菌株接种于大白菜自交系 A224 1 上 发病症状与田间症状一致 取接种后 病斑进行病原菌再分离 鉴定 鉴定病原与接种的 菌株 ALP 1 完全一致 确定采自哈尔滨市向阳乡 东北农业大学实验实习基地的大白菜细菌性角斑病 病原菌为丁香假单孢菌丁香致病型 Pseudomonas syringae pv syringae van Hall 2 2 接种苗龄 湿度及温度对大白菜细菌性角斑 病发病的影响 2 2 1 不同处理的发病情况 从表 2可以看出 大 白菜细菌性角斑病发病率和病情指数最高的均是处 理 3 处理 2次之 参照 九五 国家攻关组制定 的大白菜病毒病和霜霉病的群体分级标准和其他病 害抗性鉴定等级划分标准 马燕勤 等 2018 孙 叶烁 等 2019 处理 2 的病情指数为 30 06 属 于抗病等级 而 2018 年自交系 A224 1 田间发病 重于其他育种材料 同时 7 8叶期大白菜接种 3 d 后开始发病 明显早于 3 4叶期和 5 6叶期 综 合各方面因素考虑 处理 3 苗龄 7 8 叶期 接 种温度 25 30 接种湿度 90 100 为大白 菜细菌性角斑病发病的最佳条件组合 种苗龄的极差最小 表明苗期抗性鉴定受接种温度 的影响最大 接种湿度影响次之 接种苗龄对其影 响最小 且最佳优化条件为 A 3 B 3 C 3 2 2 3 病情指数方差分析 进一步的方差分析结果 表明 表 3 C因素和 B因素的 F值均大于 F 0 01 6 23 说明这两个因素各水平间差异达极显著水 平 二者对细菌性角斑病发病的影响均较大 A因 素 F值小于 F 0 05 3 93 不同苗龄间差异不显著 方差分析结果与极差分析的结果基本保持一致 表 3 大白菜细菌性角斑病病情指数方差分析结果 变异 来源 自由 度 df 偏差平方 和 SS 方差 MS F值 F 0 05 F 0 01 区组 2 0 38 0 19 0 56 3 93 6 23 A 2 9 75 4 97 3 17 B 2 21 13 8 03 7 35 C 2 59 17 22 36 13 45 误差 e 18 5 79 0 32 总变异 26 81 39 注 表示差异极显著 2 3 不同接种浓度对大白菜细菌性角斑病发病的 影响 确定大白菜细菌性角斑病发病的最优条件组 合后 选取田间有抗感差异的 3 个大白菜自交系 264 1 1 203 1 331 1 进行最佳接种浓度筛选 从表 4 可以看出 当菌液浓度达到 1 10 10 cfu mL 1 时 接种 10 d 后 3 个自交系的病情指数分别 为 33 21 40 27 57 95 分别表现为抗病 耐病 感病 1 10 8 cfu mL 1 和 1 10 12 cfu mL 1 浓度 菌液接种 10 d 以及 3 个浓度菌液接种 7 d 3 个自 交系之间抗感差异区分度欠佳 所以最佳接种浓度 为 1 10 10 cfu mL 1 应在接种后 10 d 进行调查 表 2 试验设计及极差分析结果 处理编号 因素 发病 率 病情 指数 A B C 1 3 4叶期 50 60 15 20 5 00 1 27 2 5 6叶期 70 80 20 25 41 67 30 06 3 7 8叶期 90 100 25 30 61 67 39 24 4 3 4叶期 70 80 25 30 26 67 12 41 5 5 6叶期 90 100 15 20 11 67 2 83 6 7 8叶期 50 60 20 25 15 00 9 95 7 3 4叶期 90 100 20 25 18 33 11 12 8 5 6叶期 50 60 25 30 21 67 12 07 9 7 8叶期 70 80 15 20 13 33 1 55 k1 25 60 21 05 7 06 k2 45 04 44 92 51 31 k3 51 77 53 54 64 04 R 26 17 32 49 59 98 主次顺序 C B A 优水平 A 3 B 3 C 3 优组合 A 3 B 3 C 3 2 2 2 病情指数极差分析 为了分析接种苗龄 接 种温度 接种湿度对大白菜细菌性角斑病发病的影 响程度 对这 3个因素进行极差分析 由表 2可以 看出 接种温度的极差最大 其次为接种湿度 接 3 结论与讨论 大白菜细菌性角斑病的最适发病温度为 25 28 张淑霞 等 2006 本试验设计了 3个 表 4 不同接种浓度对大白菜细菌性角斑病发病的影响 接种浓度 cfu mL 1 病情指数 7 d 10 d 331 1 203 1 264 1 1 331 1 203 1 264 1 1 1 10 8 13 36 R 22 16 R 27 56 R 21 35 R 29 93 R 40 18 T 1 10 10 21 67 R 35 57 T 43 23 T 33 21 R 40 27 T 57 95 S 1 10 12 34 15 T 53 36 T 60 57 S 47 75 T 54 47 T 67 75 S 注 R 抗病 T 耐病 S 感病 66 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 接种温度 15 20 20 25 和 25 30 为 了更接近于自然环境将昼夜温差设置为 5 试验 结果表明温度因素对细菌性角斑病发病影响较大 15 20 不利于发病 25 30 发病较重 说明 高温有利于细菌性角斑病发病 本试验接种后发现 湿度越大发病越明显 在接种湿度为 90 100 的条件下最易发病 这一结论与张淑霞等 2006 阴雨天易发病且病菌会借风雨和灌溉水等方式进行 传播的研究结果相符 本试验确定适宜的接种温度 为 25 30 接种湿度为 90 100 符合细菌 性角斑病田间发病规律和发病基本条件 笔者多年 田间观察发现大白菜细菌性角斑病多在 8 月上中 旬 大雨过后空气潮湿的时候大面积发生 而且发 病程度更为严重 目前 关于大白菜细菌性角斑病接种的最适苗 龄未见报道 据田间发病调查统计结果 大白菜进 入莲座期且遇阴雨天气时易发病 而且多在大白菜 外叶发生 严重时病斑会相互连片 本试验结果表 明 接种苗龄对发病的影响与接种温度和接种湿度 相比属于次要因素 但是不同接种苗龄仍然对大白 菜细菌性角斑病发病产生影响 7 8 叶期接种更 容易发病 说明大白菜细菌性角斑病在大苗龄植株 上更易发病 这也与田间观察结果相符 尽管到目前为止 还未见大白菜细菌性角斑病 抗性鉴定方法方面的报道 但是接种浓度对蔬菜作 物抗病性鉴定结果的影响应该是很大的 浓度过低 植株不易发病 而浓度过高会导致耐病品种和抗病 品种发病程度偏重 不易于区分不同品种间的抗性 差异 本试验结果表明 接种浓度对大白菜细菌性 角斑病发病的影响较大 菌液浓度为 1 10 10 cfu mL 1 时 接种 10 d 后可以区分不同品种间的抗 感病差异 因此确定该浓度为大白菜苗期活体接种 的最佳浓度 本试验仅是对大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方 法的初次探讨 希望能对我国大白菜抗细菌性角斑 病育种提供借鉴 参考文献 关钟燕 1990 黄瓜细菌性角斑病苗期抗病性鉴定技术研究 北方 园艺 Z2 1 2 马柏壮 李莹 张艳菊 秦智伟 周秀艳 2013 我国现行推广黄 瓜品种及种质资源对细菌性角斑病的抗性评价 中国蔬菜 18 72 80 马燕勤 李勤菲 司军 宋洪元 任雪松 2018 甘蓝抗软腐病离 体鉴定方法探究 植物保护 44 6 136 140 孙叶烁 郝玲玉 张杰 张鲁刚 2019 大白菜菌核病抗性鉴定 方法研究 西北农林科技大学学报 自然科学版 47 12 123 129 张吉光 陈璐 张管曲 胡小平 王保通 2010 黄瓜细菌性角斑 病菌的分离与鉴定 西北农业学报 19 12 183 187 张淑霞 李浙青 杨晓云 张清霞 2006 大白菜细菌性角斑病的 发生与防治 上海蔬菜 3 65 Bull C T Goldman P Koike S T 2004 Bacterial blight on arugula a new disease caused by Pseudomonas syringae pv alisalensis in California Plant Disease 88 12 1384 1387 Bull C T Ortiz Lytle M C Ibarra A G du Toit L J Reynolds G 2015 First report of bacterial blight of crucifers caused by Pseudomonas cannabina pv alisalensis in Minnesota on arugula Eruca vesicaria subsp sativa Plant Disease 99 3 415 416 Harighi B 2007 Angular leaf spot of cucumber caused by Pseudomonas syringae pv lachrymans in Kurdistan Plant Disease https doi org 10 1094 PDIS 91 6 0769A Nay M M Souza T L P O Raatz B Mukankusi C M Gon alves Vidigal M C Abreu A F B Melo L C Pastor Corrales M A 2019 A review of angular leaf spot resistance in Common Bean Crop Science 4 1376 1391 Takikawa Y Takahashi F 2014 Bacterial leaf spot and blight of crucifer plants Brassicaceae caused by Pseudomonas syringae pv maculicola and P cannabina pv alisalensis Journal of General Plant Pathology 80 6 466 474 Yamamoto S Kasas H Arnold D L Jackson R W Vivian A Harayama S 2000 Phylogeny of the genus Pseudomonas intrageneric structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes Microbiology 146 2385 2394 Establishment of Identification for Resistance to Bacterial Angular Leaf Spot in Chinese Cabbage REN Junhui LIU Yan JI Jingjing CHEN Zhiqiang ZHANG Yaowei College of Horticulture Landscape Architecture Northeast Agricultural University Harbin 150030 Heilongjiang China 67 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 Abstract Recently damages brought by bacterial angular leaf spot to Chinese cabbage in north and northeastern China has been aggravated year by year Breeding cultivars resistant to angular leaf spot has become an important research direction for breeding of Chinese cabbage But until now a complete identification for Chinese cabbage resistance to angular leaf spot has not yet been established This experiment carried out isolation and identification on pathogen of bacterial angular leaf spot in Chinese cabbage planted at the experiment and practice base of Northeast Agricultural University and confirmed this pathogen was Pseudomonas syringae pv syringae van Hall Taking this isolate as inoculating pathogen and Chinese cabbage inbred line A224 1 as test material this experiment adopted orthogonal experiment design of L 9 3 4 analyzed the effects of inoculation temperature inoculation humidity and seedling age on occurrence of bacterial angular leaf spot The experiment also took inbred line 264 1 1 203 1 and 331 1 as test material to screen out appropriate inoculating concentration The results showed that the optimal condition combination for occurrence of bacterial angular leaf spot in Chinese cabbage was 25 30 inoculation temperature 90 100 inoculation humidity 7 8 leaf stage seedling age and optimal inoculation concentration was 1 10 10 cfu mL 1 Keywords Chinese cabbage bacterial angular leaf spot resistance identification 宜宾芽菜是四川省宜宾市别具特色的腌制名菜 始创于清道光年间 宜宾旧称叙州 故古称 叙府芽菜 宜宾 芽菜与涪陵榨菜 南充冬菜 内江大头菜被誉为四川四大名菜 宜宾芽菜除本省销售外还远销我国昆明 港澳地区及 东南亚各国 1982 年被评为四川省优质产品 1985 年被评为全国优质产品 近年来 经过精加工的宜宾 碎米芽菜 以其质量上乘 方便价廉而深受群众喜爱 宜宾芽菜为地理标志保护产品 获有地理标志证明商标 其地域范围为东经 130 36 105 20 北纬 27 50 29 16 含宜宾市行政区划范围内的 10 个区 县所辖地域 宜宾芽菜在长期发展过程中形成了一套独特的加工工艺 据资料记载 在清光绪年间 叙州近郊的农户在冬末春 初 选用当地芥菜 二平桩 的嫩茎划成筷子粗细的丝晒成半干 以每 100 kg 鲜菜可得干菜 10 13 kg 为准 将晒好 的菜置桶内分层撒盐拌匀 另熬糖液至挑起成丝的程度 与菜混匀 并加香料 装坛 腌制时间在 1年以上 现在在 传统工艺基础上结合现代食品科技和管理 做出的芽菜更加味香爽口 营养丰富 宜宾芽菜加工原料 二平桩 为四川宜宾地方特有品种 属于小叶芥类 成熟后的嫩茎柔嫩而富有弹力 为制作 宜宾芽菜的最佳原料 其次 宜宾市属于中亚热带湿润季风气候 常年温和湿润 空气和土壤环境中含有丰富的适宜 腌制发酵的微生物 这些大量的有益微生物在芽菜腌制发酵过程中产生了宜宾芽菜独特的风味 这与宜宾市另外一个 享负盛名的特产 五粮液 两者之间有着异曲同工之妙 宜宾芽菜在长期的发展过程中 在产地自然环境和人文因素的共同影响下 逐渐形成了独特的风味 并得以代代 相传 成为四川省家喻户晓的传统酱腌菜 宜宾芽菜含有氨基酸 蛋白质 维生素 脂肪等多种营养成分 具有 香 甜 脆 嫩 鲜 等特点 食用广泛 荤素咸宜 冷热皆可 是蒸 炒 汤菜和面食的好佐料 宜宾芽菜能与各类粮食 禽蛋 蔬菜制成多种精美的传统面点 菜肴 鲜香可口 回味绵长 在川菜中独领风骚 张德纯 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京 100081 宜宾芽菜 中国地理标志产品 68 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文